Способ определения иммунодефицитных состояний Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине и может быть применено как лабораторный метод определения иммунологического статуса больного.

Цель изобретения - упрощение и повышение точности способа за счет определения иммунодефицитных состояний, основанный на оценке экспрессии рецепторов к факторам роста (интерлейкинам) на клеточной мембране.

Способ осуществляется следующим образом.

Мононуклеарные клетки из венозной периферической крови, забранной стерильно из локтевой вены и гепаринизированной (10-25 ЕД/мл крови) выделяют центрифугированием на градиенте плотности фиколлверографина по методу Вбут. Мононуклеарные клетки культивируют в среде N: 199 (Ин-т полиомиелита и вирусного энцефалита) в концентрации 1-2 х 106 мл с ФГА или КОН А (Сэрва, ФРГ) в дозе 5-10 мкг/мл при 37°С. в течение 14-16 ч в центрифужных пробирках. После культивирования клетки центрифугировали при 500°С. Надосадок удаляли и клетки ресуспендировали в 0,1 мл среды № 199. Суспензию клеток переносили в кювету, содержащую 0,8 мл среды инкубации следующего состава: 110 мМ NaCI, 5 мМ глюкозы, 2,5 мМ MgCl2. 0,65 мМ люминала, 10 мМ трис HCI. рН 7,4. Определяли уровень спонтанной хемилюминесценции с помощью люминометра (ЛКБ, Швеция). Не нарушая светоизоляции системы, в кювету

CN

сл

VJ

N 00

добавляли 0,1 мл среды, содержащей интер- лейкин-1 или интерлейкин-2, и определяли уровень активированной хемилюминесценции. Вычисляли отношение

1 а

1 СП

величин активированной и спонтанной хемилюми- несцении (индекс активации). Индексы активации, характерные для здоровых доноров и для больных с иммунопатологическими состояниями подтверждают изобретение. Иммунодефицитные состояния были диагносцированы известным способом.

. Интерлейкин-1 и интерлейкин-2 получали из среды культивации мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров. Мононуклеарные клетки разделяли на прилипающие и неприлипающие к стеклу культивацией в пенициллиновых флаконах в концентрации 2-4x10 /мл с 20%-ной эмбриональной телячьей сыворотки при 37°С в течение 45-60 мин. Неприлипшие клетки переносили в новые флаконы. Прилипшие клетки снимали холодным раствором Версена (4-6°С), центрифугировали и ресуспендировали в среде № 109. Для получения среды, содержащей интерлейкин-1, прилипающие клетки культивировали в концентрации 0,2-0,4x10 /мл в среде № 199 с 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки. Через 72 ч надосадок собирали и хранили при -20°С. Для получения супернатанта, содержащего интерлейкин-2, неприлипающие клетки в концентрации 1x10 /мл культивировали в среде № 199 с 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки и с 10 мкг/мл ФГА. Через 72 ч надосадок собирали и хранили при -20°С. При выполнении способа возможно использование коммерческих препаратов интерлейкина-1 или ин- терлейкина-2.

П р и м е р 1. Больной Б., 36 лет поступил в отделение рекоструктивной хирургии глаза ВНИИ ГБ МЗ СССР с жалобами на жгучие боли в правом глазу,-светобоязнь и ухудшение зрения. При обследовании было выявлено, что роговица инфильтрирована, прозрачность нарушена, имеется множество пузырьков высыпаний. Был диагностирован герпетический кератоувеит в стадии обострения заболевания. На основании длительного рецидивирующего течения заболевания было сделано предположение, что у больного имеет место иммунодефицитное состояние, усугубляющее течение заболевания. Для параллельного проведения оценки экспрессии рецепторов к интерлейкинам у больного была забрана кровь. При использовании предлагаемого способа по снижению индекса активации хемилюминесценции интерлейкином-1 до 10,2%, интерлейкином-2 до 9,10% было диагностировано иммунодефицитное состояние через 18ч после забора крови. Через 80 ч эти данные были подтверждены с помощью известного способа оценки экспрессии рецепторов к интерлейкинам.

П р и м е р 2. Больной И., 26 лет, поступил в радиологическое отделение МНИ РРИ с жалобами на опухолевидные образования

0 в области шеи, лихорадку, плохое самочувствие. При обьективном обследовании в области шеи, подмышечных впадин пальпируются уплотненные пакеты лимфоузлов. При биопсии обнаружены клетки Березовского5 Штернберга, на основании чего был поставлен диагноз лимфогранулематоза. Для оценки экспрессии рецепторов к интерлейкинам у больного была забрана кровь. При использовании данного способа у больного

0 было диагностировано иммунодефицитное состояние по снижению индекса активации хемилюминесценции до 15% для интерлейкина-1 и до 17% для интерлейкина-2. Результаты были получены через 18 ч после

5 забора крови. Полученные результаты были подтверждены с помощью известного способа через 80 ч после взятия крови. Таким образом; диагностика иммунодефицитного состояния была сокращена на 62 ч.

0П р и м е р 3. Больной Г., 6 лет, находился

на лечении в детской клинической больнице № 10 г Москвы Жалоб не предъявлял. Объективно - признаки болезни Дауна. Поступил по поводу длительной вялотекущей

5 болезни верхних дыхательных путей. При оценке экспрессии рецепторов к интерлейкинам у больного было диагностировано иммунодефицитное состояние. При параллельной оценке экспресии рецепторов

0 предлагаемым способом было также диагностировано иммунодефицитное состояние поснижению индекса активации хемилюминесценции интерлейкином-1 до 18,5%, ин- терлейкином-2 до 14,2%. Срок диагностики

5 был также сокращен на 62 ч.

Таким образом, предлагаемый способ обладает рядом преимуществ по сравнению с известным ранее способом диагностики иммунодефицитных состояний: меньшей

0 трудоемкостью и длительностью (сокращение срока постановки диагноза на 62 ч), высокой точностью и воспроизводимостью (значение индекса активации, вычисленное по данным хемилюминесцентного метода,

5 колеблется в пределах 2-5% в пяти параллельных пробах), отсутствием необходимости дорогостоящих меченых реактивов, прогрессивностью (использование современного высокочувствительного метода биофизического анализа).

Формула изобретения

Способ определения иммунодефицит- ных состояний путем активации мононукле- арных клеток крови с помощью интерлей- клна-1 или интерлейкина-2 с последующей оценкой митогенного действия на клетки, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повышения точности способа.

дополнительно перед активацией интерлей- кинами мононуклеарные клетки культивируют 16-18 ч в присутствии митогенэ, далее сравнивают уровень активации митогенами и интерлейкинами с помощью хемилюми- несценции и при снижении хемилюминес- ценции с интерлейкином-1 до 18,5% и ниже и интерлейкином-2 до 17% и ниже определяют иммунодефицитное состояние.

Изобретение относится к медицине и может использоваться в клинической иммунологии для оценки иммунного статуса больных и при проведении диспансеризации населения. Целью изобретения является упрощение и повышение точности анализа. Способ определения иммунодефицит- ных состояний заключается в определении уровня экспрессии рецепторов к факторам роста (интерлейкинам) на поверхности им- мунокомпетентных клеток с помощью хеми- люминесцетного метода. Мононуклеарные клетки из периферической крови человека культивируют в течение 16-18 ч в присутствии митогена, затем определяют уровень активации этих клеток экзогенными интер- лейкинами по сравнению с уровнем спонтанной хемилюминесценции в суспензии клеток в присутствии пюминола. При имму- нодефицитных состояниях отмечают резкое снижение активации хемилюминесценции интерлейкинами 1 и 2 (для интерлейкина-1 18,5% и ниже, для интерлейкина-2 17% и ниже). W fe