Способ получения очищенной нейраминидазы холерного вибриона Советский патент 1991 года по МПК C12N9/24 

Изобретение относится к биотехнологии, к получению ферментов, частности нейраминидазы холерного вибриона.

Целью изобретения является упрощение и уморение способа и увеличение выхода целевого продукта.

Способ заключается в том, что используют штамм Escherichia coli HB 101 pRD 39, fvfe 124 (коллекция государственного научно- исследовательского института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасе- вича), содержащий гены нейраминидазы холерного вибрирна. Культуральную жидкость штамма кишечной палочки диализуют против дистиллированной воды, концентрируют, затем разводят и очищают гель- фильтрацией с использованием 3- компонентной фильтрующей системы ультрагелей АсА 34:44:54 в соотношении 1:1:1 Элюцию ведут 0,01 М ацетатным буфером, рН 5,6.

На фиг,1 показан профиль элюции фермента при фильтрации культуральной жидкости Е coli 124 через ультрагели АсА, где 1 - оптическая плотность при 280 нм, 2 - ней- раминидазная активность.

П р и м е р 1. Культивирование штамма- продуцента осуществляют глубинным способом в колбах на 3000 мл, содержащих 500 мл бульона Хоттингера с 0,1% хлори- $того кальция, рН 7,2 при шуттелировании и 30°С в течение 8 - 10 ч. В питательную среду

о сл сл о со

4

вносят 5 об.% 18- часового посевного материала Е.соМ № 124, выросшего на среде этого же состава. После выращивания клетки отбрасывают центрифугированием, а культуральную жидкость диализуют против дистиллированной воды и лиофилизируют или концентрируют любым доступным способом в 7- 10 раз.

Для очистки 3 г лиофильно высушенного фильтрата Е.соМ № 124 растворяют в минимальном количестве дистиллированной воды и наносят на колонку (2х100см), заполненную последовательно ультрагелями АсА 34:44:54 в соотношении 1:1:1 и уравновешенную 0,01 М ацетатным буфером, рН 5,6. Скорость элюции 60 мл/ч, объем фракций 5 мл. Нейраминидаза опережает пиг- менти связанные с ним низкомолекулярные белки и выходит четким, компактным пиком активности. Фракции, обладающие нейра- минидазной активностью, объединяют и анализируют чистоту в электрофорезе поли- акриламидного геля.

Нейраминидазную активность определяют тиобарбитуровым методом. За единицу активности принимают также такое количество фермента, которое отщепляет 1 мкг N-ацетилнейраминовой кислоты от овомуцина-белка куриных яиц в течение 15 мин при 37°С.

Удельная активность полученного фермента 4300 ед/мг. Выход по активности 83%.

Таким образом, благодаря эффекту дозы гена в клетках предлагаемого штамма- продуцента E.coll № 124 получают высокоактивную культуральную жидкость (суммарный выход фермента определяется активностью исходного препарата), а использование для очистки 3- компонентной фильтрующей системы ультрагелей позволяет одноэтапно получить гомогенный препарат нейраминидазы холерного вибриона в течение 1,5 - 2 ч.

На фиг.2 приведены результаты э,лект- рофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, подтверждающие гомогенность полученного препарата нейраминидазы.

Формул-а изобретения

Способ получения очищенной нейраминидазы холерного вибриона, включающий очистку культуральной жидкости культуры продуцента, отличающийся тем, что,

с целью упрощения и ускорения способа и увеличения выхода целевого продукта, используют культуральную жидкость штамма продуцента Escherlchla colt ГИСК № 124, а очистку ведут гель-фильтрацией через систему ультрагелей АсА 34:44:54 в соотношении 1:1:1.

Изобретение относится к биотехноло гии, а именно к получению ферментов, в частности нейтраминидазы холерного вибриона. Целью изобретения является упро щение и ускорение способа, а также увеличение выхода целевого продукта. Способ заключается в том, что используют штамм Escherichia coli HB 101 pRD 39 № 124, содержащий гены нейраминидазы холернсмо виб риона. Культуральную жидкость диализируют против дистиллированной воды, концентрируют и очищают гель- фильтрацией с использованием трехком- понентной фильтрующей системы ультрагелей АсА 34:44:54 в соотношении 1:1:1. Элюцию ведут 0,01 М ацетатным буфе ром, рН 5,6. Удельная активность целевого продукта 4300 ед/мг, выход по активности 83%, время очистки 1,5 - 2 ч. Продукт гомогенен по данным ЭФ в ПААГ в присутствии ДДС-Na. 2 ил. сл С

ед/мг

-то

-2000

Щиг.1

70,8

92,5

66,2

Фиг г