РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА, ЭКСПРЕССИРУЮЩАЯ КЛОНИРОВАННЫЙ ГЕН CEF VIBRIO CHOLERAE (ВАРИАНТЫ), И ШТАММ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ CEF VIBRIO CHOLERAE (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2007 года по МПК C12N15/70 C12N1/21 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии, медицинской микробиологии и может быть использовано для изучения свойств, биохимической и биологической активности цитотонического фактора cef (CHO cell elongating factor) Vibrio cholerae.

Роль Cef в патогенезе холеры и в качестве самостоятельного фактора вирулентности нехолерогенных штаммов практически не изучена. Исследования фактора Cef требуют наличия его препаратов, наиболее перспективным способом получения которых является использование продуцентов - рекомбинантных штаммов кишечной палочки, содержащих клонированный ген.

Известен штамм Vibrio cholerae JBK 70 биовара эльтор (см. статью McCardell B.A., Kothary M.H., Hall R.H., Sathyamoorthy V. Identification of a CHO cell elongating factor of Vibrio cholerae O1: Microbial Pathogenesis, 29, 2000, 1-8), из клеточных экстрактов которого был выделен препарат Cef, представляющий собой термолабильный белок с молекулярной массой (ММ) 85 кДа и pI 3,8, имеющий уникальную N-концевую аминокислотную последовательность, обладающий эстеразной активностью, способностью вызывать накопление жидкости в кишечнике мышей-сосунков и удлинение клеток CHO (CHO cell elongating factor), не сопровождающееся повышением уровней цАМФ или простагландина Е₂, что указывало на механизм его действия, отличный от такового холерного токсина.

Недостатком известного продуцента является то, что холерные вибрионы продуцируют множество ферментативно и биологически активных веществ, поэтому для исследования свойств Cef необходимо достижение высокой степени очистки исследуемого белка, что требует использования большого количества бактериальной массы и дорогостоящего оборудования, а также соблюдения режима работы с возбудителями особо опасных инфекций, что возможно только в специализированных лабораториях учреждений противочумной системы.

Известен вакцинный штамм Vibrio cholerae CVD 103-Hg классического биовара (см. статью Sathyamoorthy V., Hall R.H., McCardell B.A. et al. Purification and characterization of a cytotonic protein expressed in vitro by the live cholera vaccine candidate CVD 103-Hg: Infection and Immunity, 68, 2000, 6062-60650), из культуральной жидкости которого был получен препарат фактора Cef, первоначально обозначенного как S-CEP (secreted CHO cell elongating protein), представляющий собой термолабильный белок с ММ 79 кДа, N-концевая аминокислотная последовательность которого была лишь отчасти гомологична таковой Cef вибриона эльтор, обладающий способностью вызывать накопление жидкости в кишечнике мышей-сосунков и удлинение клеток CHO.

Однако для получения очень малого количества препарата требуются крайне большие объемы культуральной жидкости, а также необходимо проведение многоступенчатого процесса очистки от сопутствующих биологически активных факторов и соблюдения режима работы с возбудителями особо опасных инфекций.

За прототип выбран способ получения продуцентов рекомбинантных белков Cef холерных вибрионов эльтор и классического биовара (см. статью McCardell B.A., Sathyamoorthy V., Michalsky J. et al.: Microbial Pathogenesis, 32, 2002, 165-172), заключающийся в клонировании генов в Escherichia coli в составе векторной плазмиды pPICZαA и последующей их экспрессии в штамме дрожжей Pichia pastoris Х-33, трансформированном рекомбинантными плазмидами PVNS1 и PVNS2.

Недостатками прототипа являются образование в дрожжевом хозяине гликозилированного продукта с молекулярной массой 114 кДа, который сохраняет эстеразную активность и обусловливает удлинение CHO, но утрачивает способность вызывать накопление жидкости в кишечнике мышей-сосунков и не поддается декликозилированию без потери активности, а также длительный срок культивирования продуцента (3 суток) и необходимость использования в качестве индуктора крайне ядовитого метилового спирта. Кроме того, сконструированы продуценты Cef холерных вибрионов только двух биоваров О1 серогруппы, что ограничивает возможность сравнительного анализа свойств Cef холерных вибрионов O1, О139 и неО1/не O139 серогрупп.

Техническая задача изобретения - создание рекомбинантных плазмид и штаммов Escherichia coli, экспрессирующих клонированный ген cef (CHO cell elongating factor) Vibrio cholerae разных биоваров и серогрупп под контролем Р_BAD-промотора.

Задача решается путем создания:

- новой рекомбинантной плазмиды pCef61B, экспрессирующей клонированный ген cef (CHO cell elongating factor) холерного вибриона биовара эльтор в штаммах кишечной палочки;

- новой рекомбинантной плазмиды pCef69B, экспрессирующей клонированный ген cef (CHO cell elongating factor) холерного вибриона классического биовара в штаммах кишечной палочки;

- новой рекомбинантной плазмиды pCef49B, экспрессирующей клонированный ген cef (CHO cell elongating factor) холерного вибриона не O1/не O139 (О13) серогруппы в штаммах кишечной палочки;

- новой рекомбинантной плазмиды pCef31B, экспрессирующей клонированный ген cef (CHO cell elongating factor) холерного вибриона 0139 серогруппы (Бенгал) в штаммах кишечной палочки.

- штамма Escherichia coli Jm103pCef61B - продуцента Cef (CHO cell elongating factor) холерного вибриона биовара эльтор посредством трансформации штамма Е. coli Jm103 рекомбинантной плазмидой pCef61B.

- штамма Escherichia coli Jm103pCef69B - продуцента Cef (CHO cell elongating factor) холерного вибриона классического биовара посредством трансформации штамма Е. coli Jm103 рекомбинантной плазмидой pCef69B.

- штамма Escherichia coli Jm103pCef49B - продуцента Cef (CHO cell elongating factor) холерного вибриона не O1/не О139 (О13) серогруппы посредством трансформации штамма Е. coli Jm103 рекомбинантной плазмидой pCef49B.

- штамма Escherichia coli Jm103pCef31B - продуцента Cef (CHO cell elongating factor) холерного вибриона О139 серогруппы (Бенгал) посредством трансформации штамма Е. coli Jm103 рекомбинантной плазмидой pCef31B.

На фиг.1 приведена схема векторной плазмиды pBAD18 (X81838), являющейся исходной для получения рекомбинантных плазмид pCef61B, pCef69B, pCef49B и pCef31B.

На фиг.2 представлена схема конструирования рекомбинантных плазмид на примере pCef61B.

Плазмида pBAD18 (см. фиг.1) несет ген устойчивости к ампициллину (bla) и содержит Р_BAD-промотор арабинозного (araBAD) оперона и ген araC, продукт которого осуществляет регуляцию этого промотора: включает транскрипцию в присутствии арабинозы и подавляет ее в присутствии глюкозы. Полилинкер MCS2 встроен в плазмиду таким образом, что экспрессия клонированных генов осуществляется под контролем Р_BAD-промотора и поддается строгой регуляции.

Плазмиды pCef61B, pCef69B, pCef49B и pCef31B представляют собой генно-инженерные варианты, полученные путем встраивания в вектор pBAD18 генов cef V. cholerae O1 биоваров eltor и classicae, nonO1/nonO139 (О13) и О139 (Бенгал) соответственно (см. фиг.2).

Будучи трансформированы в штаммы кишечной палочки Jm103, BW, M17 либо DH5α, рекомбинантные плазмиды экспрессируют клонированный ген под контролем Р_BAD-промотора. Экспрессия гена подавляется глюкозой и индуцируется арабинозой. В отсутствие глюкозы и арабинозы экспрессия клонированных генов происходит на низком уровне.

Штаммы E. coli Jm103pCef61B, Jm103pCef69B, Jm103pCef49B и Jm103pCef31B представляют собой генно-инженерные варианты, полученные путем трансформации соответствующих рекомбинантных плазмид в штамм E. coli Jm103, и являются продуцентами плазмидной ДНК и Cef V. cholerae O1 биоваров eltor и classicae, nonO1/nonO139 (О13) и О139 (Бенгал) соответственно. Штаммы депонированы в коллекции музея живых культур Российского противочумного института "Микроб" под номерами КМ 190, КМ 191, КМ 189 и КМ 188.

Полученные штаммы-продуценты характеризуются следующими признаками.

Культурально-морфологические свойства

Все штаммы в жидких питательных средах (бульоне Хоттингера, мясопептонном бульоне) образуют равномерную муть, на плотных - круглые, выпуклые, гладкие, белые полупрозрачные колонии с ровным краем, тестообразной консистенции.

Физиолого-биохимические свойства

Все штаммы разлагают с образованием кислоты и газа глюкозу, на среде Эндо образуют лактозонегативные колонии. Ауксотрофы. При индукции арабинозой проявляют эстеразную активность по отношению к твинам 20, 40, 60 и 80. Штаммы E. coli Jm103pCef61B (KM 190), Jm103pCef69B (KM 191) и Jm103pCef49B (KM 189) в условиях индукции также гидролизуют трибутирин. Штамм E. coli Jm103pCef31B (KM 188) не обладает активностью по отношению к трибутирину.

Устойчивость к антибиотикам

Штаммы устойчивы к 50 мкг/мл стрептомицина, что является свойством исходного штамма Jm103, и к 50-100 мкг/мл ампициллина за счет присутствия гена bla в составе векторной плазмиды pBAD18.

Биологическая активность

Осветленные ультразвуковые дезинтеграты клеток помимо эстеразной активности обладают способностью вызывать удлинение клеток СНО и L929 и накопление жидкости в кишечнике мышей-сосунков.

Способ получения и использования рекомбинантных плазмид и штаммов-продуцентов иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Клонирование гена cef и получение рекомбинантных плазмид.

Для ПЦР-синтеза гена cef используют праймеры, сконструированные нами на основе анализа нуклеотидной последовательности гена cef VCA0863 (АЕ004414): прямой - 5'-TCACGAATTCTCTGGAGTCGAACATGAAAC-3' и обратный - 5'-AAGCTCTAGAGAGAGTGCGCTTTTCGCTTT-3'.

Поскольку амплификаты необходимо встроить в плазмидный вектор pBAD18 в ориентации, обеспечивающей направление транскрипции под контролем Р_BAD-промотора, на 5'-конце каждого праймера внесен сайт рестрикции для эндонуклеазы, образующей липкие концы: EcoRI для прямого праймера и XbaI - для обратного (в приведенных последовательностях выделены жирным шрифтом и подчеркнуты) в соответствии с порядком расположения сайтов рестрикции в полилинкере векторной плазмиды.

Из штаммов V. cholerae eltor P-9961, V. cholerae classicae 569B, V. cholerae О13 17449 и V. cholerae О139 Р-16131 фенольным методом выделяют хромосомные ДНК, которые служат матрицами для синтеза искомого гена.

300 мкл реакционной смеси для полимеразной цепной реакции содержат 0,5 нг ДНК-матрицы и следующие компоненты в указанных концентрациях: по 2,5 мкм каждого праймера, по 2,5 мМ всех четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, 3 ед. Taq-полимеразы и 0,1 объема прилагаемого к ней 10-кратного буфера. Смесь разливают по 30 мкл в 0,5-мл пластиковые пробирки и осуществляют реакцию по следующей схеме: 94°С - денатурация (1 мин), 63°С - отжиг (40 сек), 72°С - синтез (1 мин). Всего проводят 30 циклов амплификации, в последнем цикле время синтеза увеличивают до 30 минут. По окончании реакции смесь подвергают электрофорезу в 0,7% агарозном геле в трис-ацетатном буфере в присутствии 0,5 мкг/мл бромистого этидия, затем просматривают в ультрафиолетовом свете, вырезают участок геля с амплифицированным фрагментом, размером 2473 т.п.н., выделяют последний элюцией, очищают смесью фенол:хлороформ:изопропанол в соотношении 25:24:1 и осаждают этиловым спиртом.

Полученные таким образом ПЦР-амплификаты и ДНК векторной плазмиды pBAD18 гидролизуют эндонуклеазами рестрикции EcoRI и XbaI согласно рекомендациям фирмы-изготовителя ферментов, очищают в агарозном геле и лигируют с использованием ДНК-лигазы фага Т4 и прилагаемого к ней буфера согласно рекомендациям изготовителя.

Лигазными смесями трансформируют компетентные клетки E. coli Jm103, приготовленные накануне обработкой хлористым кальцием. После стандартной процедуры трансформации (0°С - 40 мин, 42°С - 2 мин, 0°С - 5 мин) клетки разводят в 10 раз средой LB с 0,5% глюкозы, подращивают в течение 1 ч и высевают на агар LB, содержащий 50 мкг/мл ампициллина и 0,5% глюкозы. Добавление глюкозы существенно, поскольку на стадии клонирования продукт гена cef может оказать токсическое действие на клетки кишечной палочки. Посевы инкубируют при 37°С.

На следующие сутки выросшие ампициллинрезистентные колонии тестируют с помощью следующих праймеров для детекции гена cef:

прямой - 5'-CTCCCTACTCTGCTCAGCACTCTGG-3' и

обратный - 5'-TCGAGCCCAAGGCCTGTTTG-3', и отбирают позитивные клоны, из которых выделяют плазмидную ДНК и подтверждают наличие вставок длиной около 2,5 т.п.н. гидролизом этих плазмид эндонуклеазами рестрикции EcoRI и XbaI с последующим электрофорезом в агарозном геле.

Для выявления способности рекомбинантов к синтезу Cef культуры рекомбинантных клонов, а также контрольный штамм, содержащий векторную плазмиду pBAD18 без вставки, выращивают в жидкой среде LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, в течение 3-4 ч и затем индуцируют 0,2% арабинозы в течение 1-2 ч при 37°С с шуттелированием при 150 об/мин. Клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в забуференном физиологическом растворе (PBS) и разрушают ультразвуком на дезинтеграторе PG-100 MSE 150 W (Англия) с помощью конического стержня при частоте колебаний 20 кГц и амплитуде 12-16 мкм в течение 1 мин. Остатки клеток отделяют центрифугированием, а прозрачные супернатанты используют для тестирования. Содержание белка определяют методом Лоури.

Пример 2. Изучение ферментативной активности препаратов рекомбинантных белков Cef, полученных по примеру 1.

Ферментативную активность осветленных дезинтегратов клеток штаммов E. coli Jm103pCef61B (KM 190), E. coli Jm103pCef69B (KM 191), E. coli Jm103pCef49B (KM 189) и E. coli Jm103 pCef31B (KM 188) определяют при 37°С в лунках агара, содержащего 0,5% твинов 20, 40, 60 и 80 и 0,01% хлористого кальция для визуализации расщепления, а также трибутирина и 0,01% гуммиарабика либо 0,2% тритона Х-100 в качестве эмульгатора. Положительные результаты учитывают по образованию вокруг лунок зон преципитации жирных кислот ионами кальция для твинов и зон просветления - для трибутирина.

Все рекомбинанты проявляют высокую эстеразную активность по отношению к твинам 20, 40 и 60 (зоны преципитации образуются при внесении в лунки разведений дезинтегратов клеток, выращенных без индукции и с индукцией, содержащих 40 и 1 мкг общего белка/мл и выше соответственно) и менее выраженную - по отношению к твину 80 (400 и 4 мкг/мл). В дезинтеграте штамма, содержащего векторную плазмиду pBAD18 без вставки, независимо от индукции описанные эффекты отсутствуют.

Дезинтеграты штаммов E. coli Jm103pCef61B (KM 190), E. coli Jm103pCef69B (KM 191) и E. coli Jm103pCef49B (KM 189) в тех же разведениях также расщепляют трибутирин, тогда как E. coli Jm103 pCef31B (KM 188) и контрольный штамм E. coli Jm103pBAD18 не обладают такой способностью.

Пример 3. Изучение биологической активности Cef in vitro.

Биологическую активность осветленных дезинтегратов рекомбинантных штаммов E. coli Jm103pCef61B (KM 190), E. coli Jm103pCef69B (KM 191), E. coli Jm103pCef49B (KM 189) и E. coli Jm103pCef31B (KM 188) изучают in vitro на модели клеточных культур линий СНО-К1 и L-929, которые вносят в 96-луночные планшеты в количестве 10³ клеток на 90 мкл среды RPMI-1640 (Sigma), содержащей 1% сыворотки плода коровы, и добавляют по 10 мкл испытуемых препаратов в разведениях 1:10-1:800 в той же среде и инкубируют в СО₂-инкубаторе (Sanjo) при 37°С. Морфологическое изучение культур проводят в течение 2-х дней с помощью инвертированного микроскопа (Reichert).

Через 1-2 суток после внесения разведений осветленных дезинтегратов клеток E. coli JM103, содержащих рекомбинантные плазмиды, происходит удлинение клеток в разведениях опытных образцов с концентрацией общего белка ≥25 мкг/мл, тогда как в контрольных лунках какое-либо удлинение клеток отсутствует.

Пример 4. Изучение биологической активности Cef in vivo.

Биологическую активность осветленных дезинтегратов клеток рекомбинантных штаммов E. coli Jm103pCef61B (KM 190), E. coli Jm103pCef69B (KM 191), E. coli Jm103pCef49B (KM 189) и E. coli Jm103pCef31B (KM 188) изучают in vivo на модели мышат-сосунков. Животным весом 3-4 г (по 6-10 на каждый вариант) через задний проход с помощью инсулинового шприца со специальным наконечником вводят по 100 мкл препаратов с концентрацией общего белка 300 мкг/мл. Через 5 ч после введения животных умерщвляют и определяют FA (отношение суммарного веса желудка и кишечника к весу тела). Статистическую обработку результатов проводят с помощью программы "Primer of Biostatistics" v.4.03. В контрольной группе (после введения PBS) среднее значение FA составляет 0,058±0,010, препарат из штамма, содержащего векторную плазмиду, не вызывает накопления жидкости (FA=0,057±0,012), т.е. собственные белки кишечной палочки не обладают токсичностью для мышат-сосунков. В опытных группах наблюдается накопление жидкости: значение FA составляет 0,076-0,079±0,006-0,010. Отличия от контролей статистически достоверны при Р<0,005.

Таким образом, рекомбинантные белки Cef сохраняют все три вида описанной для них активности: эстеразную и биологическую in vitro и in vivo.

Использование рекомбинантных плазмид pCef61B, pCef69B, pCef49B и pCef31B и штаммов KM 190, KM 191, KM 189 и KM 188 позволит проводить широкомасштабные исследования биологической активности Cef Vibrio cholerae как фактора вирулентности возбудителей холеры разных биоваров и серогрупп. Дальнейшие исследования нового токсина V. cholerae Cef с помощью рекомбинантов, полученных заявителями, имеет принципиальное значение для оценки его роли в вирулентности, выяснения механизма его действия на эукариотические клетки и эволюционных связей с аналогичными токсинами других возбудителей. Кроме того, плазмиды являются перспективными для создания более активных продуцентов на основе штаммов кишечной палочки.

Рекомбинантные штаммы E. coli являются перспективными в качестве продуцентов негликозилированного токсина для изучения его биологического действия и влияния на активность других факторов вирулентности. Cef является единственным токсическим продуктом, синтезируемым данными штаммами, поэтому в качестве препаратов могут быть использованы неочищенные лизаты или дезинтеграты бактериальных клеток.

Преимуществом предлагаемых продуцентов по сравнению с холерными вибрионами является также то, что их культивирование не требует соблюдения режима работы с возбудителями особо опасных инфекций.

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии, медицинской микробиологии и может быть использовано для изучения роли цитотонического фактора cef (CHO cell elongating factor) в патогенезе холеры, его биохимической и биологической активности. Описаны новые рекомбинантные плазмиды, содержащие в составе векторной плазмиды pBAD18 клонированный ген cef V. cholerae O1 биоваров eltor и classicae, nonO1/nonO139 (O13) и O139 (Бенгал) - pCef61B, pCef69B, pCef49B и pCef31B соответственно. Плазмиды получены встраиванием ПЦР-амплификата гена cef Vibrio cholerae classicae по сайтам EcoRI-XbaI в полилинкер MCS2 векторной плазмиды pBAD18 в ориентации, обеспечивающей направление транскрипции под контролем Р_BAD-промотора. Продуцентами рекомбинантных плазмид и белка Cef являются штаммы E. coli Jm103pCef61B (KM 190), Jm103pCef69B (KM 191), Jm103pCef49B (KM 189) и Jm103pCef31B (KM 188), полученные путем трансформации штамма Е. coli Jm103 рекомбинантными плазмидами. Продукция Cef происходит при индукции арабинозой. Рекомбинантные белки Cef сохраняют все три известных вида активности: эстеразную и биологическую in vitro и in vivo. 8 н.п. ф-лы, 2 ил.

1. Рекомбинантная плазмида pCef61B, экспрессирующая клонированный ген cef (CHO cell elongating factor) холерного вибриона биовара эльтор, встроенный по сайтам EcoRI-XbaI в полилинкер MCS2 векторной плазмиды pBAD18, в штаммах кишечной палочки под контролем р_BAD-промотора.2. Рекомбинантная плазмида pCef69B, экспрессирующая клонированный ген cef (CHO cell elongating factor) холерного вибриона классического биовара, встроенный по сайтам EcoRI-XbaI в полилинкер MCS2 векторной плазмиды pBAD18, в штаммах кишечной палочки под контролем Р_BAD-промотора.3. Рекомбинантная плазмида pCef49B, экспрессирующая клонированный ген cef (CHO cell elongating factor) холерного вибриона неO1/неO139 (O13) серогруппы, встроенный по сайтам EcoRI-XbaI в полилинкер MCS2 векторной плазмиды pBAD18, в штаммах кишечной палочки под контролем Р_BAD-промотора.4. Рекомбинантная плазмида pCef31B, экспрессирующая клонированный ген cef (CHO cell elongating factor) холерного вибриона O139 серогруппы (Бенгал), встроенный по сайтам EcoRI-XbaI в полилинкер MCS2 векторной плазмиды pBAD18, в штаммах кишечной палочки под контролем Р_BAD-промотора.5. Штамм Escherichia coli Jm103pCef61B, несущий плазмиду pCef61B по п.1 - продуцент Cef (CHO cell elongating factor) Vibrio cholerae eltor.6. Штамм Escherichia coli Jm103pCef69B, несущий плазмиду pCef69B по п.2 - продуцент Cef (CHO cell elongating factor) Vibrio cholerae classicae.7. Штамм Escherichia coli Jm103pCef49B, несущий плазмиду pCef49B по п.3 - продуцент Cef(CHO cell elongating factor) Vibrio cholerae nonO1/non)139(O13).8. Штамм Escherichia coli Jm103pCef31B, несущий плазмиду pCef69B по п.4 - продуцент Cef(CHO cell elongating factor) Vibrio cholerae O139 (Bengal).