Штамм @ @ @ 101 @ 39-продуцент нейраминидазы холерного вибриона Советский патент 1987 года по МПК A61K39/108 C12N9/00 C12R1/19 

112

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для получения нейраминидазы холерного вибриона.

Целью изобретения является созда- ние штамма, способного к продукции больших количеств нейраминидазы хо- лерного вибриона и обеспечивающего безопасность работы.

Штамм сконструирован на базе штамма кишечной палочки НВ 101 при проведении генноинженерных работ путем введения в него с помощью генетической трансформации искусственно полученной, рекомбинантной плазмиды pRD 39. Эта плазмида несет в своем составе ограниченный Hind III - сайтами фрагмент хромосомной ДНК возбудителя холеры биотипа .эльтор (штамм 5879) с генами синтеза нейраминидазы. Плазмида имеет молекулярную массу 7,7 мегадальтон, способна амплифицироваться в присутствии хлорамфеникола и -.функционирует на основе вектора pBR 322. Она имеет 4 участка узнавания для эндонуклеазы рестрикции Hind III, 2 - для Есо R V 4 - для Есо R I, по 1 - для Sal GI, Bam Н I, PSt I n О - для Ml ul.

Штамм Escherichia coli HB pRD 39 депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского ин- ,

ститута стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича МЗ СССР под номером 124.

Культурно-морфологические признаки.

Короткие палочки размером 1,0- 2,0x0,3-0,4 мкм. Неподвижны. Грам- отрицательны с умеренно выраженным полиморфи.змом. На агаре LB и Хоттин- гера образуют мутные колонии серовато-белого цвета. Вызывают помутнение бульона Хоттингера с образова- нием хлопьевидного осадка.

На минимальной среде зависят от тиамина, лейцина и пролина. Устойчивы к антибиотикам пенициллиновой группы (более 100 мкг/мл) за счет образования пенициллиназы. Ферментируют с образованием кислоты и газа

ВНИИПИ

Заказ 294/1

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

O

5

0

5

2

5

0 5

0

0

78.2

глюкозу, арабинозу, маннозу , галактозу. Не ферментируют лактозу. Несут мутацию в гее А гене хромосомы,в связи с чем проявля1Ьт чувствительность к УФ-лучам и метилметансуль- фанату. Лизируются кишечными фагами Т и лямбда-вир.

Штамм аВирулентен для белык мышей и морских свинок при подкожном, аэрозольном и внутриконыонктиваль- ном заражении в дозе до 10 м.кл., что сообш;ает ему преимущества в режимном отношении.

Штамм Escherichia coli 124 образует в контрелируемых условиях большие количества нейраминидазы холерного вибриона, в 8-10 раз превьш1аю- щие уровень продукции фермента родительским штаммом Vibrio cholerae eltor 5879.

Приме p. Для выращивания клеток предлагаемого штамма можно использовать самые разнообразные питательные спеды, включая бульон Мартена (рН 7,6) и бульон Хоттенге- ра (рН 7,4), дрожжевой бульон (рН 7 ,3) и бульон ЛБ (рН 7,1), различные пентоны и другие среды.

Культивирование клеток штамма осуществляют в условиях энергичного Встряхивания на шюттель-аппарате (175 об/мин) в колбах с 3%-ным раствором бактопентона Дифко (рН7,6-7,8), дополненного 0,1% хлорида кальция и 0,5% хлорида натрия, при 30-37 С в течение 18-22 ч. Далее колбы охлаждают до 4 С, клетки отделяют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин, а надосадочную жидкость используют в качестве источника целевого фермента. Активность нейраминидазы в жидкости ис-. следует тиобарбитуровым методом Уоррена. Обычно в 1 мл культураль- ной жидкости содержится 300-400 ед, фермента.

Штамм E.coli 124 стабильно образу- .ет нейраминидазу холерного вибриона на искусственных средах, что значительно упрош,ает процесс получения и очистки целевого продукта.

Тираж 596

Подписное

ШТАММ Escherichia coli HE 101 pRD 39, № 124 (коллекция Государственного научно-исследовательского института стандартизации и кoнтpoлJ медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича) - проду цент нейраминидаэы холерного вибриона.