Способ определения индивидуальной чувствительности к иммуномодулятору Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 

И

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовно для подбора иммуномодуляторов в клинической практике. Цель изобретения - повышение точности способа з счет индивидуального подбора иммуномодуляторов неспецифической резистентное™ организма. Эффективность препарата предварительно оценивают по степени усиления реакции антителозависимой цито- токсичности нейтрофилов периферической крови до и после инкубации ин еитро с данным иммуномодулятором. Способ может быть использован в клинике для профи- лактики и лечения различных инфекционных осложнений.

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической иммунологии.

Цель изобретения - повышение точности способа за счет индивидуального подбора иммуномодуляторов неспецифической резистентности организма.

Способ осуществляется следующим образом.

Подбор иммуномодулятора для конкретного больного состоит из трех этапов: подготовки клеток-эффекторов (нейтрофи- лы крови) и клеток-мишеней (эритроциты кур); инкубации взвеси нейтрофилов с набором иммуностимуляторов; определение спонтанной и стимулированной цитотоксич- ности нейтрофилов для каждого препарата и выбор препарата по наибольшему показателю индекса цитотоксичности нейтрофила (ИЦН).

Подготовка клеток-эффекторов и клеток-мишеней. Клетки-эффекторы (нейтрофи- лы) выделяют из периферической крови центрифугированием (3500 об /мин) в течение 30 мин в градиенте плотности верогра- фина (1,119 г/см). Очищенную взвесь нейтрофилов получают, удаляя прилипающие клетки инкубацией в чашках Петри в течение 1 ч при 37°С. Клетки для исследований доводят в среде 199 до концентрации 2,0 Х106/мл.

Клетки-мишени (эритроциты кур) (ЭК) трижды отмывают при центрифугировании (1000 об/мин в течение 10 мин), используют в концентрации 10 клеток/мл в питательной среде следующего состава: среда 199 с добавлением до 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 300 мкг/мл а -глутэми- на и 80 мкг/мл гентамицина.

сь

(Л 00

о ю 1

Цитотоксический тест ставят в пластиковых 96-луночных планшетах. В опытные лунки добавляют по 0,1 мл гипериммунной к эритроцитам кур сыворотки кролика в разведении 1:100, 0,1 мл взвеси клеток-эффекторов (нейтрофилы больного) и 0,1 мл клеток-мишеней (ЭЗ). Стимулированную анти- телозависимую цитотоксичность (A3 Ц) определяют по то же методике, но в качестве клеток-эффекторов берут нейтрофилы после преинкубации с различными препаратами.

Планшеты мягко центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин для создания плотного контакта между клетками-эффектораи клетками-мишенями. Смесь инкубируют при 37°С в течение 4 ч в присутствии 5% СОа. После инкубации центрифугируют и 0,2 мл супернатанта анализируют по выделению Сг с отсчетом эмиссии супернатанта. На любом радиометре с колодцевым счетчиком радиоактивности или на гамма-счетчиках отечественного (гамма-12) и зарубежного (Jamma, ВНР) производства.

Процент общей радиоактивности, выделенной из клеток-мишеней в супернатанте, берут как степень лизиса. Процент специфического лизиса высчитывают по формуле

ЦИ с-В Х1°°

где ЦИ - цитотоксический индекс или процент специфического лизиса клеток-мишеней,

А - радиоактивность супернатанта из опытного образца;

В - спонтанное освобождение изотопа в супернатант;

С - максимальный выход изотопа из клеток-мишеней, который получают добавлением в соответствующие лунки неполного детергента (1 % Тритон Х-100 в 1 н. HCI).

Для иммунологической реакции используют нейтрофилы в концентрации 2,0 106/мл.

Для оценки степени стимуляции реакции АЗЦ применяют индекс стимуляции нейтрофилов (ИСН), который вычисляют по формуле

,

где В - индекс цитотоксичности после преинкубации нейтрофилов с раствором имму- номодуляторов;

А - индекс цитотоксичности в спонтанном АЗЦ-тесте.

Пример. Больная Б.34 лет. с диагнозом: острый лейкоз, миеломонобластный вариант. Двусторонняя очаговая пневмония. Состояние больной при поступлении тяжелое. Жалобы на повышение температуры-тела, кашель с выделением слизистой

мокроты, резкую слабость. Данные рентгенологических исследований подтвердили диагноз двусторонней пневмонии.

Картина крови:(28.07.87): эритроциты

5,0x10 /л, гемоглобин 108 г/л. цветовой показатель (ц.п.) 1,00; тромбоциты (тр.) 110,0 х 10 9/л; лейкоциты (л,) 1,4 х 10 /л. Лейкоцитарная формула: бласты (бл.) 8%. палочкоядерные нейтрофилы (п/я) 4%, сег-

ментоядерные нейтрофилы (с.) 12%, лимфоциты (лимф.) 76%, СОЭ 42 мм/ч.

Иммунологические показатели больной Б. Т-лимф. 10%, В-лимфоциты 12%; количество нейтрофилов, экспрессирующих рецепторы к FC - фрагменту, IgG 20%, к Сз.в-компоненту комплемента 11%; опсони- ческая активность сыворотки (ОАС) 0,08 усл.ед; количество фагоцитирующих нейтрофилов (ФАН) 10%; индекс фагоцитоза

(ИФ) 2,1; завершенность фагоцитоза (ЗФ% - 2,0); количество формазан-положительных нейтрофилов (ФПН) - 1 %.

Из-за выраженной лейкопении (1,4 х 10 л, относительной (12%) и абсолютной

(0,168 х 10 9ЗЛ) нейтропении, резкого угнетения клеточного и гуморального звена иммунитета, а также факторов неспецифической резистентности организма,проведение специфической химиотерапии,

направленной на эрадикацию лейкозного (опухолево-перерожденного) клона клеток, в данном случае не представлялось возможным.

Проведен подбор иммуномодулятора

по предлагаемому способу: ИЦН в спонтанном тесте 12,6%,

ИПпирогенал21,5% ИСН 1,706 ИЦэимозан 22,6 ИСН 1,793 ИЦпродигиозанЗО.2 ИСН 2,398

ИПпропер-мил 22,3 ИСН 1,769

Таким образом, наибольшим стимулирующим эффектом по отношению к нейтро- филам больной обладает продигиозан, который был назначен по общепринятой

схеме: 1-й день - 50 мкг/(1,0 мл препарата), затем по 100 мг через 3 дня. На курс лечения 450 мкг препарата. Наряду с этим проводилась антибиотическая и симптоматическая терапия.

Через неделю состояние больной значительно улучшилось, нормализовалась температура, улучшились показатели крови. Данные лабораторных и иммунологических исследований больной после проведенного

лечения:

Гемограмма: эр. 3,6 х 1012/л; Нв - 116 г/л, ц.п. 1,0; тромб. 108,0 х 10 9/л; л.4,9 х 10 9/л. Лейкоцитарная формула: п 4%; с 37%; э 2%. мон. 10%; лимф. 47%; СОЭ 7 мм /ч; Тлимф.19%; В-лимф.17; ОАС 1,2; ФАН 30%; ИФ 9,2; ЭФ 1,1; ФПН 5%.

Таким образом, после противовоспалительной терапии с применением индивидуально подобранного стимулятора неспецифической резистентности организма у больной нормализовалось число лейкоцитов, значительно (в 3 раза) повысилось содержание сегменто-ядерных нейтрофи- лов, активизировалась их фагоцитарная функция, в периферической крови появились моноциты (10%). Больному затем был назначен и закончен в полном объеме курс интенсивной полихимиотерапии.

Способ за счет повышения точности оп- ределен я иммуностимулятора позволяет значительно сократить сроки лечения больных, в том числе больных гемобластозами, с наличием инфекционных осложнений. Так например, у больных острым миелобластным

лейкозом с 24,5 до 18.2 дн. при хроническом лимфобластном лейкозе с 28 3 до 24,5 дн

У больных, получавших иммуностимуляторы, подобранных предлагаемым способом, с профилактической целью инфекционные осложнения возникали значительно реже. Формула изобретения Способ определения индивидуальной чувствительности к иммуномодулятору, включающий выделение клеток крови, инкубирование их с иммуномодулятором, проведение и оценку результатов иммунологической реакции, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, из крови выделяют нейтрофилы, осуществляют реакцию ан- тителозависимой цитотоксичности, опосредованной нейтрофилами. и при усилении цитотоксичности по сравнению с контролем без препарата определяют индивидуальную чувствительность к препарату.