СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2011 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для оценки неспецифической антибактериальной резистентности организма человека.

Известен метод определения неспецифической антибактериальной резистентности организма [RU 2068997 C1, опубл. 10.11.1996]. Сущность изобретения состоит в том, что перед подготовкой мазков готовят культуру бактерий Serratia marcescens для использования ее в качестве объекта фагоцитоза, опсонизируют бактериальную взвесь сывороткой здоровых лиц, инкубируют опсонизированную и неопсонизированную культуру бактерий с лейкоконцентратом больных, исследуют суммарную цитохимическую активность миелопероксидазы и катионных белков до и после инкубации, после чего рассчитывают индекс стимуляции нейтрофилов. При величине индекса 0,5 и ниже определяют снижение антибактериальной резистентности организма. Недостатком метода является длительность его выполнения и необходимость микроскопической оценки активности ферментов, что снижает точность и объективность способа.

Задачей изобретения является создание нового информативного способа определения антибактериальной резистентности организма человека.

Задача достигается тем, что с помощью хемилюминесцентного анализа исследуют функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов периферической крови пациента, определяют индекс бактериальной активации нейтрофильных гранулоцитов (ИБА-индекс), представляющий собой отношение площади под кривой хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов, индуцированной бактериальной суспензией Staphylococcus epidermidis, к площади под кривой спонтанной хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов. При величине этого индекса ниже 1,47 определяют высокий уровень антибактериальной резистентности, а при величине, равной 1,47 и выше, - низкий уровень антибактериальной резистентности организма человека.

Низкая антибактериальная резистентность характеризуется увеличением восприимчивости организма к бактериальным инфекциям; увеличением длительности заболевания и присоединением сопутствующих бактериальных инфекций, а также утяжелением острого периода и быстрым переходом заболевания в хроническую форму. Цифра 1,47 получена опытным путем на основании сопоставления данных проведенного хемилюминесцентного анализа, результатов медицинского обследования и данных о последующих обострениях хронической бактериальной инфекции.

Активированные нейтрофильные гранулоциты являются мощными эффекторами и запускают механизмы каскадных реакций, обеспечивающих развитие воспаления. Противоинфекционное действие нейтрофильных гранулоцитов связано, главным образом, с генерацией активных форм кислорода, а одним из методов, позволяющих оценить кислородзависимую биоцидность нейтрофильных гранулоцитов, является хемилюминесцентный анализ. Нейтрофильные гранулоциты несут на своей поверхности широкий спектр рецепторов, часть из которых может взаимодействовать с неопсонизированными бактериями (CR- и Toll-рецепторы). Фагоцитоз без опсонизации связан с наличием у микробов особых факторов вирулентности, с помощью которых они проникают в клетки. Фагоцитоз является одной из главных систем защиты организма от чужеродных агентов и играет важную роль при гнойно-воспалительных заболеваниях, особенно при стафилококковой инфекции. Несомненным преимуществом метода является применение в качестве индуктора бактерий Staphylococcus epidermidis, которые способны вызывать тяжелые воспалительные заболевания.

Способ осуществляют следующим образом. Из венозной крови обследуемого пациента выделяют нейтрофильные гранулоциты. Для этого к 5 мл крови с гепарином добавляют 1 мл полиглюкина. Смесь инкубируют в течение 30 мин при 37°С для ускорения осаждения эритроцитов. Полученный лейкоцитарный супернатант дважды отмывают в растворе Хенкса без фенолового красного по 10 мин при 400 g. Супернатант сливают, оставшиеся нейтрофильные гранулоциты разводят в 1 мл раствора Хенкса и получают взвесь. Подсчитывают количество нейтрофильных гранулоцитов в камере Горяева. Для проведения хемилюминесцентного анализа используют следующие реактивы: донорскую сыворотку (группа крови АВ, резус-фактор отрицательный), раствор Хенкса (без фенолового красного), люминол в концентрации 100 мкг/мл. Готовят пробу: 200 мкл взвеси нейтрофильных гранулоцитов, 20 мкл донорской сыворотки, 240 мкл раствора Хенкса, 50 мкл люминола и 40 мкл бактериальной суспензии Staphylococcus epidermidis в концентрации 10⁶ КОЕ/мл. Хемилюминесцентный анализ проводят в двух кюветах: спонтанная хемилюминесценция осуществляется без добавления индуктора, во вторую кювету добавляют бактериальную суспензию Staphylococcus epidermidis. Измерение хемилюминесцентного ответа осуществляют при помощи хемилюминесцентного анализатора, например «CL3604», в течение 90 мин. Регистрацию результатов и управление хемилюминесцентным анализатором осуществляют через компьютер. Получают кривые спонтанной и индуцированной бактериями хемилюминесценции. Индекс бактериальной активации нейтрофилов (ИБА-индекс) определяют по формуле:

ИБА=S_{индуцированная}/S_{спонтанная},

где:

S_{индуцированная} - величина площади под кривой хемилюминесценции, индуцированной бактериальной суспензией Staphylococcus epidermidis;

S_{спонтанная} - величина площади под кривой спонтанной хемилюминесценции.

При ИБА-индексе ниже 1,47 диагностируют высокий уровень антибактериальной резистентности, при ИБА-индексе, равном 1,47 или выше, - низкий уровень антибактериальной резистентности организма.

Данный метод апробирован на 12 больных хроническим гайморитом, поступивших на лечение в ЛОР-отделение НУЗ "Дорожная клиническая больница" на ст.Красноярск ОАО РЖД, и на 45 здоровых лицах. Результаты обследования представлены в табл.1.

По результатам исследования установлено, что у всех 45 здоровых лиц величина ИБА-индекса ниже 1,47 (100% совпадение). У 11 больных также отмечено совпадение результатов анализа. У 1 больного величина индекса ниже 1,47. Таким образом, совпадение метода определения антибактериальной резистентности у больных хроническими гайморитами составляет 91,7%. При статистическом анализе (с подсчетом медианы (Me) и интерквартильного разброса (С₂₅-С₇₅)) установлены статистически достоверные различия (Р<0,001) по уровню ИБА в группах здоровых и больных людей (табл.2).

Таблица 2 Уровень ИБА в группах здоровых и больных лиц Группы N Me C₂₅ C₇₅ Здоровые 45 0,930000 0,630000 1,330000 Больные 12 1,700000 1,640000 2,055000

Клинический пример 1. Больной И., 43 г. История болезни №2149. Поступил на стационарное лечение в ЛОР-отделение НУЗ "Дорожная клиническая больница" на ст. Красноярск ОАО РЖД с диагнозом хронический риносинусит. При поступлении состояние больного средней степени тяжести, беспокоят слабость и головные боли. Проведено исследование заявляемым способом. ИБА равен 1,96 (выше 1,47). Следовательно, у обследуемого низкий уровень антибактериальной резистентности. Клинический пример 2. Пациент С., 41 год, был обследован всеми основными врачами-специалистами, включая врача-инфекциониста и врача-иммунолога, при проведении профилактического осмотра сотрудников ОАО "Горэлектрсвязь" на базе клиники НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН. Признан здоровым. Проведено исследование заявляемым способом.

ИБА равен 1,15 (ниже 1,47). Следовательно, у обследуемого высокий уровень антибактериальной резистентности.

Технический результат предлагаемого способа:

- автоматизированное определение функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов;

- оценка результатов не зависит от субъективных факторов.

Таким образом, способ информативен, точен, отвечает современным требованиям к методам лабораторной диагностики, позволяет значительно упростить процесс определения факторов неспецифической защиты организма, его функциональной активности и резервных возможностей, дает возможность выявить недостаточность фагоцитарной защиты и ее реактивной или патологической активации.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и описывает способ определения антибактериальной резистентности организма человека при заболеваниях, вызванных стафилоккоковой инфекцией, основанный на исследовании нейтрофилов крови, при этом функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов периферической крови пациента исследуют с помощью хемилюминесцентного анализа, определяют индекс бактериальной активации нейтрофилов (ИБА-индекс), представляющий собой отношение площади под кривой индуцированной бактериями Staphylococcus epidermidis хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов к площади под кривой спонтанной хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов, и при величине этого индекса ниже 1,47 определяют высокий уровень антибактериальной резистентности, а при величине, равной 1,47 и выше, - низкий уровень антибактериальной резистентности организма. Способ информативен, точен, отвечает современным требованиям к методам лабораторной диагностики и позволяет прогнозировать характер, сроки течения заболевания и осложнений бактериальной этиологии у больных разных категорий. 2 табл.

Способ определения антибактериальной резистентности организма человека при заболеваниях, вызванных стафилоккоковой инфекцией, основанный на исследовании нейтрофилов крови, отличающийся тем, что функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов периферической крови пациента исследуют с помощью хемилюминесцентного анализа, определяют индекс бактериальной активации нейтрофилов (ИБА-индекс), представляющий собой отношение площади под кривой, индуцированной бактериями Staphylococcus epidermidis хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов, к площади под кривой спонтанной хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов, и при величине этого индекса ниже 1,47 определяют высокий уровень антибактериальной резистентности, а при величине равной 1,47 и выше - низкий уровень антибактериальной резистентности организма.