Способ получения антивирусного препарата из дрожжей Советский патент 1991 года по МПК A61K35/76 

Изобретение относится к технологии получения биологически активных препаратов для растениеводства и животноводства.

Цель изобретения - упрощение технологического процесса получения антивирусного препарата из дрожжей и повышение выхода биомассы продукта.

Цель достигается тем, что вместо рибо- нуклеаэы и фенола для очистки препарата используют органическую кислоту, предпочтительно уксусную, выполняющую одно- временно и функцию активного экстрагента. Кислота применяется в концентрации 5-6%, не снижающей активности получаемого препарата, но обеспечивающей его высокий выход и хорошую очистку от примесей. По предлагаемому способу в качестве исходного сырья можно использовать не только дрожжевую биомассу, выращенную в лабораторных условиях, но и промышленные кормовые дрожжи.

Отделенные от культуральной жидкости и высушенные клетки гомогенизируют, растворимые вещества из гомогената экстрагируют 5-6%-ной уксусной кислотой, центрифугируют и осадок отбрасывают. Экстракт упаривают в вакууме при 50°С и охлаждают, целевой продукт из концентрата осаждают двумя объемами этанола, центрифугируют, осадок растворяют в теплой воде и высушивают сублимацией.

Выделенные данным способом препараты состоят преимущественно из полисахаридов, хорошо растворимы в воде и обладают высокой антивирусной активностью.

П р и м е р 1 . Дрожжи Candida troplcalls К-41 выращивают в ферментерах на аэрированной жидкой среде следующего состава: (NH-ikSO/i 3 г/л; NaCI 0,3 г/л; MgSO 0.4 л;

CN СЛ ЧЭ iO СЛ

(л)

НаРОз 1 г/л; K2HPO/jO,1 г/л; глюкоза 5 г/л; биотин 2 мкг/л.

Биомассу отделяют от культуральной жидости центрифугированием (3000 об/мин, 15 ин), высушивают в сублимационной сушке 30°С, давление- 10 н/м2) и используют по мере получения антивирусного препарата. рожжевые клетки гомогенизируют с помощью шаровой мельницы, растворимые вещества экстрагируют 6%-ной уксусной кислотой (2 ч при +2°С), осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость доводят до нейтрального значения рН добавлением 5 н NaOH и концентрируют 1:5 упариванием (50°С) в вакууме. К охлажденному концентрату добавляют 2 объема 96%-ного этанола и осаждают целевой продукт при +2°С. Осадок собирают центрифугированием и растворяют в теплой (50°С) дистиллированной воде. Раствор центрифугируют, осадок отбрасывают, а препарат сушат в сублимационной сушке.

Выход очищенного препарата составляет 5,7% сухого веса дрожжей. Препарат имеет вид аморфного белого порошка, хорошо растворим в воде, термостабилен, не гигроскопичен и может длительно храниться в сухом месте без изменения порошковидной консистенции и высокой антивирусной активности. В его составе более 80% углеводов, примесь белков составляет не более 3%, нуклеиновых кислот - следы.

Пример 2. В качестве исходного материала используют сухие кормовые дрожжи промышленного изготовления. Экстракцию и очистку антивирусного начала проводят по той же схеме, что и в примере 1. Для этого применяют уксусную кислоту в 5%-ной концентрации. Выход препарата несколько ниже (4,9%), однако антивирусная активность его выше, чем при экстра- .кции 6%-ной кислотой. Препарат представляет собой аморфный порошок слабокоричневого цвета, хорошо растворим в воде, термостабилен, не гигроскопичен и может долго храниться в сухом месте без потери физических характеристик и антивирусной активности. Состоит преимущественно из полисахаридов, примеси белкой не превышают 5%, нуклеиновых кислот - 0,4%.

П р и м е р 3. Исходное сырье - промышленные кормовые дрожжи. Для экстракции и очистки антивирусного препарата исполь- зуют уксусную кислоту в оптимальной концентрации (5,5%). Выход препарата достаточно высок - 5,2%, его антивирусная активность выше, чем при экстракции веществ 6%-ной уксусной кислотой.

В табл.1 приводятся сведения о составе и активности препаратов, полученных из различных источников, в отношении вируса табачной мозаики на дурмане.

П р и м е р 4. Сухие дрожжевые клетки (40 г) обрабатывают 6%-ной уксусной кислотой по предлагаемому способу или водой (по прототипу), Растворимые вещества отделяют центрифугированием и в полученных экстрактах определяют содержание углеводов (0,2%-ным антроном в концентрированной НаЗСм) и белков (по микрометоду Бредфорда), а также антивирусную активность экстрактов (против ВТМ на листьях дурмана). Данные этого опыта приводятся в табл.2,3,4.

Целевой продукт, экстрагированный 6%-ной уксусной кислотой, по антивирусной активности существенно не отличается от продукта, полученного согласно способу- прототипу. Тем не менее содержание углеводов, являющихся действующим началом препарата, в этом препарате в 1,5 раза выше, чем в препарате, экстрагированном водой. В то же время большую долю (31%) последнего составляют белки, содержание которых в целевом продукте, экстрагиро- ванном 6%-ной уксусной кислотой, не превышает 2%

П р и м е р 5. 250 мг дрожжевых клеток Candida tropicalls К-41- высушенных лиофильно, гомогенизируют и целевой продукт из них экстрагируют 3%-, 5%-, 6%-, 8%-, 10%- или 15%-ной уксусной кислотой. Далее экстракт концентрируют упариванием в вакууме, осаждают спиртом. Определяют

суммарное содержание белков и полисахаридов в препаратах и их способность инги- бировать инфекционность ВТМ на листьях дурмана.

Данные этого опыта, приведенные в

табл.5, показывают, что по мере увеличения концентрации уксусной кислоты с 3 до 10% выход полисахаридов повышается, а выход белков, наоборот, снижается (с 3,4 до 1,4%). Дальнейшее увеличение концентрации кис0 лоты (до 15%) сопровождается снижением выхода полисахаридов. Антивирусной активностью обладают все препараты. Однако наиболее высокую активность отмечают у препаратов, экстрагированных 5-6%-ной

5 уксусной кислотой. Препараты, выделенные при более высокой концентрации кислоты (8-15%) в сравнимо низких (1 мкг/мл) концентрациях, не обладают активностью либо эта активность непостоянна. Намного мень- ией оказалась и активность препарата, экстретированного 3%-ной уксусной кислотой, вероятно, из-за присутствия примесей, снижающих активность ингибиторов, либо стимулирующих инфекционность вируса.

При испытании действия различных концентраций уксусной кислоты в качестве экстрагента целевого продукта в данном опыте нейтрализация ее щелочью сознательно не проводилась. Это дало возможность определить, насколько высокие концентрации водородных ионов могут отрицательно повлиять на активность антивирусного начала. Измерения показывают, что заданные определенной концентрацией кислоты значения рН существенно не повышаются в процессе концентрирования экстракта в вакууме благодаря испарению кислоты. Так, при концентрации кислоты 5- 6% значение рН экстракта после концентрирования продукта в вакууме не выходит за пределы 1-2, при этом антивирусная активность целевого продукта (по сравнению с более низкой концентрацией экстрагента - 3%) не уменьшалась.

Таким образом, оптимальная концентрация уксусной кислоты, обеспечивающая достаточно высокий выход препарата, отсутствие в нем существенных примесей сопутствующих белков и хорошую сохранность антивирусной активности целевого продукта, находится в пределах 5-6%.

Пример 6. В опыте используют сухие клетки дрожжей Candida tropicalis К-41.

Получение антивирусного препарата по предлагаемому способу,

40 г дрожжевых клеток гомогенизируют и целевой продукт экстрагируют 400мл 6%- ной уксусной кислоты (2 ч при температуре + 20°С), экстракт отделяют от гомогената клеток центрифугированием и упаривают до 100 мл в вакууме. Целевой продукт из концентрата осаждают двумя объемами спирта, осадок растворяют в воде и лиофи- лизируют. На всех стадиях получения препарата определяют содержание углеводов, белков в экстрактах и антивирусную активность экстрагируемых веществ.

Получение антивирусного препарата по способу-прототипу.

40 г дрожжевых клеток гомогенизируют, целевой продукт экстрагируют 400 мл воды (2 ч при температуре +20°С), экстракт от гомогената клеток отделяют центрифугированием, а затем обрабатывают его РНКазой в концентрации 20 мкг/мл (2 ч. +25°С в 0.001 М NaCI). Экстракт концентрируют в вакууме до 100 мл, а затем эмульгируют в смеси фенола и хлороформа (9:1) в течение 30 мин при комнатной температуре, водную фазу с целевым продуктом отделяют центрифугированием и подвергают диализу (24 ч) против воды. Целевой продукт из диализате осаждают 5 объемами этилового спирта осадок растворяют в воде и лиофи- 5 лиэируют. На всех стадиях получения препарата определяют содержание белков и углеводов в экстрактах и антивирусную активность экстрагируемых веществ.

Данные сравнительной оценки предла0 гаемого способа и его прототипа приводятся в табл.6. Выход препарата, полученного по предлагаемому способу, в условиях этого опыта достигает 2,5%. В то время как, используя способ - прототип, удается пол5 учить лишь около 0,7% препарата от веса исходного сырья.

Пример. Листья дурмана обрабатывают препаратом (1 мг/мл) за 48 ч до или сразу после заражения Х-вирусом картофе0 ля (ХВК) путем погружения их в раствор испытуемого препарата. Контрольные листья аналогичным образом обрабатывают водой. Инфекционный титр вируса определяют через 5 дней посредством инокуляции экс5 трактами из листьев дурмана растений Gomphrena globosa и подсчетом образовавшихся в опыте и контроле местных вирусных поражений

Данные, приведенные в табл 7, свиде0 тельствуют о существенном профилактическом эффекте в отношении ХВК. Отмечено снижение титра вируса (на 31 %) под влиянием препарата.

В системе табак - вирус бронзовости

5 томатов (ВБТ) полученный антивирусный препарат (АВП) применяют путем трехкратного опрыскивания растений до (профилактика) или после (терапия) инокуляции их инфекционным соком с интервалом 2-3

0 дня между смежными обработками. Учитывают количество местных некрозов на ино- кулированных листьях, а также число системно пораженных растений, отмечают одновременно характер и степень проявле5 ния внешних симптомов заболевания.

Данные этого опыта приведены в таблицах 8 и 9.

Как следует из приведенных результатов, полученный АВП обладает высоким

0 профилактическим и существенным терапевтическим (снижение гибели растений на 50% при 100%-ной гибели их в контроле) действием в отношении болезни табака, вызываемой ВБТ

5

Формула изобретения Способ получения антивирусного препарата из дрожжей, включающий культивирование клеток их отделение от

культуральной жидкости, экстракцию очистку, и концентрирование экстракта в вакууме с последующим осаждением целевого продукта и его сублимационным высушиванием, отличающийся тем, что, с целью

упрощения технологического процесса и повышения выхода биомассы продукта, экстракцию и очистку проводят уксусной кислотой в концентрации 5-6%.

Изобретение относится к технологии получения биологически активных препаратов. Цель изобретения - упрощение технологического процесса получения антивирусного препарата из дрожжей и повышение выхода биомассы продукта. Для этого отделенные от культуральной жидкости и высушенные клетки гомогенизируют, растворимые вещества из гомогената экстрагируют 5-6%-ной уксусной кислотой, центрифугируют и осадок отбрасывают. Экстракт упаривают в вакууме при 50°С и охлаждают, целевой продукт из концентрата осаждают двумя объемами этанола, центрифугируют, осадок растворяют в воде и высушивают сублимацией. 9 табл.

Выход, состав и антивирусная активность препаратов, выделенных

их дрожжей

Характеристика целевого продукта, экстрагированного из 40 г сухих дрожжей различными способами

Таблица 1.

Таблица 2

Моносахаридный состав антивирусных препаратов, полученных с помощью известного и предлагаемого способа

Примечание. Содержание моносахаридов в препаратах определяют с помощью

газо-жидкостной хроматографии. Препараты для ГЖХ получают путем гидролиза антивирусного препарата в 2 н серной кислоте (2 ч, 100°С).

Действие гидролаз на антивирусную активность антивирусного препарата, выделенного из дрожжей с помощью заявленного способа

Выход и антивирусная активность целевого продукта, экстрагированного из дрожжевых клеток уксусной кислотой различной концентраций

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

При м е ч а н и е. Для экстракции в каждом варианте используют 250 мг сухих клеток. стимуляция инфекционности ВТМ.

Таблица .6

Сравнительная эффективность двух способов получения антивирусного препарата из клеток дрожжей Candida tropicalis К-41

Предлага- г Экстракция 6%-ной у к- 21.4

емый

сусной кислотой

II Упаривание в вакууме

9,2

III Осаждение спиртом 2 °00

I Экстракция водой, обра- 378,0 340 ботанной РНКазой

(20 мкг/мл в 0,001 М

Nad)

II Упаривание в вакууме 234,0 1700

Обработка фенольно- хлороформной смесью, диализ, осаждение спиртом

13,6 290

Продолжение табл. 5

1120

111,4 1,9

1800

1809,2 0,5

1007,2 0,7

1218 31,0

1934 12,1

303,6 4,5

Таблица 7

Действие антивирусного преперага (ЛВП) из дрожжей на накопление Х-вир са картофеля в изолированных половинках листьев дурмана

Время инкубации половинок Инфекционность экстрактов из листьев через листьев5 дней после заражения (некрозов) лист

Вода АВП, 1 мг/мл , Ингибирование, %

48 ч до инокуляции 352431,А

о 48 ч после инокуляции 3940+1,0

+++ ,1%; °Р 5%.

Таблица 8

Профилактическое действие антивирусного препарата из дрожжей на поражаемость табака сорта Иммунный 580 ВВТ.

ВариантКоличество местных Количество растений

поражений/лист с системными симптомами болезни, Z

Вода (контроль) 11,Oil,4100

АВП, 0,02% 1,7 0,030 :

# трехкраное опрыскивание растений с интервалом 3 дня до инокуляции растений ВБТ.

Т А б.л и ц а 9

Терапевтическое антивирусное действие антивирусного препарата из дрожжей в системе табак сорта Иммунный 580 - ВБТ

- - | -.

Вариант .Колисество растений, Z...

10 дней п.и. 30 дней п.И. 50 дней п.и.

1ZZZZILI

Вода (контроль) 1000000JOOОО100

АВП, 0,,5 62,5 037,562,5 012,5 37,5 50,0

трехкратное опрыскивание с интервалом 2 дня, начатое сразу после заражения растений ВБТ: 1 - с суровыми симптомами; 2-е мягкими симптомами; 2 - погибшие.