Способ получения антивирусных препаратов из дрожжей Советский патент 1979 года по МПК C12K5/00 A01N15/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИВИРУСПЫХ ПРЕПАРАТОВ

ИЗ ДРОЖЖЕЙ

1

Изобретение относится к технологии получении физиологически активных веществ для сельского хозяйства.

Известен способ получения антивирусных веществ, преимущественно из дрожжей Candida tropicalis3B и Candida агЬогеа KA/V1..1, выращиваемых на солодовом сусле I. Этот способ включает операции отделения дрожжевых клеток от культуральной жидкости, концентрирования культуральной жидкости в вакууме, центрифугирования, диализа и осаждения целевого продукта органическим растворителем, обработки рибонуклеазой, фенолом и органическим растворителе.м.

Недостатком известного способа является низкий , малая активность получаемого продукта.

Целью изобретения является повыщение активности и выхода антивирусных препаратов.

Это достигается применением расы К-41 Cajidida tropicalis в качестве продуцента антивирусных веществ, отличающейся от ранее использованных дрожжей более высокой продуктивностью и способностью усваивать углерод из пищевого сырья при повышенных температурных режимах культиви-рования. Применение минеральной среды Ри дер с глюкозой и биотипом для выращивания дрожжей способствует накоплению значительных количеств антивирусных веществ. Кроме того, концентрирование и очистка веществ с антивирусной активностью достигаются диализом через полупроницаемую мембрану против высокомолекулярного гидрофильного вещества - полиэтиленгликоля.

из технологической схемы приготовления антивирусных препаратов исключается дорогостоящая рибонуклеазная обработка, а окончательное высушивание препарата производится путем сублимации, что обеспечивает его хорошую растворимость в воде и высокую активность.

По предлагаемо.му способу можно выделить антивирусные препараты как из клеток дрожжей, так и из культуральной жидкости. При этом необходимо последовательное выполнение следующих операций.

Дрожжи Candida tropicalis К-41 выращивают в ферментерах на аэоиоованной

жидкой среде Ридер следующего состава (г/л): (NH4)2SO4 3, NaCl 0,3; MgSO4 0,4; КН2РО4 I; K2HPO/ 0,1; глюкоза 25; биотин 2 мкг/л.

Дрожжевые клетки от культуральной жидкости отделяют центрифугированием (3000 об/мин в течение 15 мин), высушивают в сублимационной сушке при 30°С, давлении Ю н/м и используют отдельно для получения различных препаратов.

Биомассу дрожжей гомогенизируют в сухом и влажном виде в присутствии абразива, растворимые вещества экстрагируют теплой (до 45°С) водой и концентрируют с помощью водного раствора высокомолекулярного по тиэтиленгликоля (молекулярная масса 15000) через полупроницаемую (цел-, лофановую) мембрану. Растворенные в воде концентраты культуральной жидкости или дрожжевого, экстракта центрифугируют (5000 об/мин в течение 15мин) для удаления нерастворимого остатка, добавляют равный объем смеси водонасыщенного фенола к «-бутанола (10;1) и эмульгируют при ко.мнатной температуре в течение 30 мин. Водную фазу отделяют центрифугирование.м (3000 об/мин в течение 30 мин), диализируют против проточной воды (48 час) для удаления остатков феноал и н-бутанола и концентрируют до минимального объема (0,2-0,3 лJ с помощью полиэтиленгликоля через полупроницаемую мембрану. Целевой продукт из концентрата осаждают органическим растворителем (80 %-ньш этанолом) при низкой (2°С) температуре. Осадок уплотняют центрифугированием (5000 об/мин в течение 15 мин) и растворяют в теплой (до 45°С) воде. Раствор центрифугируют (5000 об/мин в течение 15 мин) осадок отбрасывают, а сунернатант повторно обрабатывают фенолом и органическими растворителями, как указано выще. Окончательное высушивание препарата из водного раствора осуществляют в субли.мационной сушке (-30°С, 10 н/м).

Пример 1. В качестве источника антивирусного препарата использована био.масса дрожжей Candida tropicalis К-41. Из 500 г су.хих дрожжей ио предлагаемому способу получено 11,0 г препарата, что составляет 2,2 вес. % исходного материала. Препарат имеет вид а.морфного белого порощка, хорощо растворим в воде, в растворе термостабилен. Влажность лиофилизированного препарата 5,0%, препарат слабо гигроскопичен, может длительное время храниться в сухом месте без изменения физических свойств и антивирусной активности.

Пример 2. В качестве источника антивирусного препарата использована культура льная жидкость, не содержащая дрожжевых клеток. Из 20 л культуральной жидкости (около 50 г сухих веществ) по предлагаемому способу получено 2,2 г препарата, т. е. около 4,4 вес. % исходного продукта. Выделенный препарат - белый аморфный порошок, хорошо растворим в воде, в растворе термостабилен, его влажность не превыщает 6%; может храниться длительное время в сухом месте без потери порошковидной консистенции, растворимости и антивирусной активности.

Общий выход препаратов из биомассы и культуральной жидкости дрожжей достигает 3,3% сухого веса исходного материала.

В табл. 1 приведены сведения о хи.мическом составе препаратов, в табл. 2 и 3 - результаты испытания их активности в отнощении вируса табачной мозаики и Х-вируса картофеля.

Препараты состоят преимущественно из полисахаридов (около 70%), примеси белков не превыщают I-3%, нуклеиновых кислот 0.21-0,26% (табл. 1). Седиметационным анализом установлена гомогенность пренарата, выделенного из дрожжевых клеток, молекулярная масса присутствующего в нем полисахарида маннана равна 14000. Препарат, полученный из культуральной жидкости дрожжей - полидисперсный.

Оба препарата обладают выраженной активностью в отношении вируса табачной мозаики и Х-вируса картофеля; 50%-ное снижение инфекционности вируса табачной мозаики наблюдается в 0,0001-0,001/о-ной концентрации препаратов (табл. 2). Препараты подавляют накопление Х-вируса картофеля в листьях дурмана, реагирующих системным заболеванием на заражение этим вирусом (табл. 3), и увеличивают выход безвирусных растений в культуре апикальных меристем. Хвмвческвй составакгёвирусных -препаратов, полученных нз К-41 (% сухого веса препарата)

Источввх Редудирукидие вещества. Белки Нуклеиновые обнаруженные в гнаро-кислоты

лизатах(РНК)

микромето- автроновым дом Хаге- методом дорка-Иенсева

Инактивация вируса табачной мозаики препаратами, полученными из дрожжей Canc/tc/д iropicali К-41 Примечани

Таблица 1

Фосфор

ОбщийНуклеотвдный

Таблида2 е: Опытные половивкн листьев Sifa.mon.wmннокулировалн вирусом табачной мозаики в присутствии антивирусного препарата в соответствующей концентрации, контрольные - вирусом без антивирусного препарата. дрожжей Canctc/a troptcafts

ВлвяЕве автввнрусвых препаратов йа рвп(5одукнвю Х- вируса картлзфепя в листьях

Datura. Stra.m.on.t.um.

Ивфекциоввость ввруса в экстрактах

Концентрация из листьев Bltuf-a Stramoaiunt препарата, % культивируемых

ва растворе ингибитора

Р ОД

я

42

ОД

Р 0,5 Примечания:

Формула изобретения

Способ получения антивирусных препаратов из дрожжей, включающий культивирование дрожжей, отделение от культуральной жидкости дрожжевых клеток и раздельную обработку их путем концентрирования культуральной жидкости в вакууме, а дрожжевых клеток путем гомогенизации, экстракции, концентрирования экстракта, диализа, осаждения целевого продукта, обработки его фенолом и органическими растворителями, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и выхода антивирусного препарата, в качестве исходной

ТабпнааЗ

Снижение инфекпионности,

%

на воде

87,5

187

культуры дрожжей используют расу К-41 Candida tropicalis, культивирование которой проводят на минеральной среде Ридер с глюкозой и биотином, а концентрирование дрожжевого экстракта проводят полиэтиленгликолем через полупроницаемую мембрану и после обработки фенолом и органическим растворителем целевой продукт из дрожжевого экстракта высушивают сублимацией.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР № 302368, кл. С 12 К 5/00, 1971. 1. Опытные половинки листьев содержат в течение 2 дней на растворе ингибитора у контрольные - на воде, а затем инокупируют X-вирусом картофеля, титр вируса определяют на 7-в день опыта путем подсчета местных некрозов, образовавшихся в результате ннокуляции экстрактами листьев гомфрены. 2. Р- уровень значимости разности инфекдионности вируса в опыте и контроле, %.