Способ определения мембранотоксического действия химических веществ Советский патент 1991 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, медицинской и микробиологической промышленности, экологии, а именно к методам исследования и количественной оценки потенциальной опасности химических веществ, может быть использовано в токсикологии для установления предельной концентрации мембранотоксического действия химических соединений, в промышленной гигиене для определения предельно допустимого уровня токсических веществ в окружающей среде.

Цель изобретения - ускорение способа.

Способ осуществляют следующим образом.

К суспензии клеток ph.Leiognathf добавляют исследуемое на токсичность химическое вещество, инкубируют и центрируют. Супернатант анализируют на содержание люциферазы. Для этого в кювету люмино- метра вносят 0,1 мл супернатанта и добав-. ляют 0,02 мл 0,01%-ного спиртового раствора миристинового альдегида. Кювету помещают в люминометр. Запуск реакции производят впрыскиванием 0,5 мл 0,05 мМ восстановленного флавинмононуклеотида. Максимум световой вспышки регистрируют самописцем или цифровым прибором и выражают в микроамперах. Степень мембранотоксического действия химических веществ определяют по величине активности люциферазы в супернатанте.

П р и м е р 1. Суспензию культуры ph.Lelognathl разливают в ряд пробирок по

Os

ел ч

00

ел

1мл и приливают по 10 мкл бутил мета кри- лата в конечных концентрациях 0,5; 1.0; 2; 4; 8; 16; 32 мМ. В качестве контроля используют 10 мкл растворителя, на котором приготовлен раствор исследуемого химического вещества. Приготовленную таким образом смесь инкубируют 5 мин при 2б°С. После инкубации неразрушенные клетки и клеточные обмотки осаждают центрифугированием. 0,1 мл надосадочной жидкости анализируют на содержание вышедшего из клеток люминесцентных бактерий фермента люциферазы по люминесцентной реакции in vitro.

Количество вышедшей люциферазы при действии бутилметакрилата в дозе 1 мМ было минимально (0,23 усл.ед. ± 0,03) и значительно не отличалось от контроля. При дозе

2мМ количество люциферазы составило 1,05 ± 0,08 усл.ед., что достоверно отличалось от контроля (Р 0,01). Полученные данные говорят, что порог мембранотокси- ческого действия бутилметакрилата равен 2 мМ.

. П о и м е о 2. Определение 50% мембра- нолитической дозы (ЕДэо). Суспензию культуры ph.Lelognathi разливают в дублях в ряд пробирок по 1 мл. В обе пробирки дубля приливают по 10 мкл определенной концентрации ксенобиотика. В данном случае это спиртовый раствор бутилакрилата в конечных концентрациях 4; 8; 16; 32; 64 мМ. В качестве первого контроля полного лизиса клеток к 1 мл культуры бактерий приливают мембранотропный антибиотик, не действующий на люминесцентную систему, пол- имиксин, в конечной концентрации 100 ед/мл. Вторым контролем на исследование тушения люминесценции непосредственно тестируемыми концентрациями ксенобиотика служат дублирующие пробирки с ксенобиотиком и культурой офотобактерий, в которые добавляют полимиксин в конечной концентрации 100 ед/мл. Контрольные и опытные пробы инкубируют 5 мин при 28°С, центрифугированием осаждают клетки и клеточные обломки и 0,1 мл. надосадочной жидкости исследуют на содержание люциферазы по люминесцентной реакции in vitro.

Результаты исследования 50% мембра- нолитической дозы для бутилакрилата представлены в табл.1.

По полученным результатам исследования вычисление истинных значений количества вышедшей из клеток люциферазы, т.е. с учетом ингибирования люминесцентной

системы непосредственно ксенобиотиком, проводят следующим образом. Свечение опытных проб умножают на коэффициент ингибирования, равный отношению контроль 1/контроль 2. Для бутилакрилата вычисляют определенные значения. Из вычисленных значений рассчитывают 50% мембранолитическую дозу (ЕДя). Вычисленная ЁДво для бутилакрилата 7,4 мм (табл.2).

Определенное значение ЕДэо для бутилакрилата по прототипу составило 12 мМ.

ПримерЗ. При сравнении времени экспозиции фотобактерий с бутилакрила- том в концентрации 7,4 мМ со временем

экспозиции эритроцитов с тем же веществом в концентрации 12 мМ установлено, что в первом случае максимальный эффект достигается за 5 мин, тогда как во втором максимальный выход гемоглобина из эритроцитов достигается за 45 мин.

Таким образом время определения мембранотоксического действия химических веществ значительно сокращается.

Формула изобретения

Способ определения мембранотоксического действия химических веществ, включающий инкубацию индикаторных клеток с исследуемыми химическими веществами,

центрифугирование и определение количества освободившегося внутриклеточного содержимого по появлению в супернатанте маркерного белка, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, индикаторными клетками служат люминесцентные бактерии, а в качестве маркерного белка используют люциферазу и определяют ее активность в супернатанте.

Таблица 1

Изобретение относится к медицине, медицинской и микробиологической промышленности, экологии, а именно к методам исследования и количественной оценки потенциальной опасности химических веществ, и может быть использовано в токсикологии для установления предельной концентрации мембранотоксического действия химических соединений, в промышленной гигиене для определения предельно допустимого уровня токсических веществ в окру- жающей среде. Цель изобретения заключается в ускорении способа определения мембранотоксического действия химических веществ. Сущность изобретения состоит в том, что клетки люминесцентных бактерий инкубируют с исследуемым веществом, центрифугируют и мембранотоксич- ность соединения определяют по появлению в супернатанте маркерного белка, люциферазы, определяя ее активность. Скорость определения мембранотоксично- го действия веществ возрастает в 9 раз по сравнению с прототипом. 2 табл. сл с

Таблица 2