Способ определения иммуносупрессивного действия ксенобиотиков Советский патент 1990 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для проведения первичного скрининга веществ на иммуномодулирующую активность.

Предлагаеьый способ позволяет оценивать иммуномодулирующее влияние продуктов метаболизма ксенобиотиков.

Цель изобретения - упрощение и по- вьииение чувствительности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Микросо№1 печени мышей линии EALB/c или DBA/2 инкубируют в присутствии ксенобиотика (в опь1тах использован акрила Ф1д). В 1 мл инкубационной смеси содержится 2-3 мг оелка млкросом; 0,2 М трис-НС буфера (рН 7,2)} 0,5 мМ ЭДТА; 150 мМ КС1; 10 мМ 9 мМ акриламида (А) 125 млн.клеток селезенки мышей СВА. Ободай объем инкубационной с меси 2,4 МП. Реакцию инициируют добавлением 3 мМ НАДФН, через 30 мин реакцию останавливают добавлением большого объема охлажденной до 4 С среды 199 с антибиотиками. Затем спленоциты осаждают центрифугированием при 1500 об/мин (4-5000g) в течение 7-10 мин. Далее клетки дважды от№1вают средой 199 центрифугированием в том же режиме и вводят в объеме 1 МП вместе с 4x10 эритроцитов барана внутривенно сингенным №1шам-ре- ципиентам. Для определения иммуностимулирующей активности используют дозу эритроцитов, равную (0,5-1)10 клеток. Мыши-реципиенты за 3-4 ч до клеточного переноса получают внутрибркг шинно 200 мг/кг циклофосфамида для подавления собственной иммунореактив- ности. Через 5 дней определяют уровень иммункого ответа по числу антител ообр азу ющих клеток методом Ерне.

СП

00

Пример , Первоначально изучали иммунодепрессивное действие А по известному способу. 9 мМ А инкубировали с 0,2 М трис-НС буфера (рН 7,2), микросомами печени мзппей BALB/c или РВА/2 в количестве 2-3 мг белка, 150 мМ КС1,. 10 мМ ilgCl, 0,6 мМ ЭДТА. Объем инкубационной смеси 1 мл. Реакцию инициировали добавлением 3 мМ НАДФН и через 15 мин останавливали помещением проб в ледяную баню и добавлением 2 мл холодной инкубационной среды. Далее микросокы осаждали центрифугированием при 105000g и 4°С в те- 1 ч. Полученный супернантант замораживали при и на следующий день определяли его иммунодепре,ссив- ную активность. Размороженный супер- натант фильтровали через миллипо- ровьщ фильтр (диаметр пор 0,45 мкм) и инкубировали в течение Г ч с нормальными клетками селезенки мьшей СВА Инкубационная смесь содержала 1 мл супернатанта и 300 млн,тест-клеток в 1,4 мл среды 199, Затем клетки трижды отмывали центрифугированием и в адой- тивном сингенном переносе определяли их иммунореактивность, как описано. Уровень иммунного ответа выражали в про- центах к контролю (инкубация клеток в среде 199), Достоверность различий при ,05 определяли с помощью критерия Стьюдента,

0

5 5 )

0

Данные свидетельствуют об отсутст- ВИИ достоверных различий между опытными и контрольной группами. Таким образом, при использовании известного способа не обнаружили иммунодепрес- сивного действия А,

П р и м ер 2, Иммунодепрессивное действие А исследовали согласно предложенному способу,

В данной постановке опыта бьшо выявлено иммунодеприссивное действие А, которое обусловлено влиянием нестабильных метаболитов. При сравнении схем опытов и результатов, приведенных в примерах 1 и 2, подтверждается преимущество.предлагаемого способа.

Формула изобретения

Способ определения иммуносупрессивно го действия ксенобиотиков, включающий инкубацию ксенобиотиков с микросомами клеток печени с последующей оценкой действия образующихся метаболитов на тест-клети селезенки мьшей в системе адоптивного сингенно- го переноса с подсчетом аитителообра- зующих клеток, отл ичающий- с я тем, что, с целью упрощения и по- вьппения чувствительности способа, тест-клетки селезенки инкубируют одновременно с ксенобиотиками и микросомами печени.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в ксенобиохимии и иммунотоксикологии. Изобретение позволяет оценивать иммунотоксичность метаболитов микросомального окисления ксенобиотиков путем подсчета антителообразующих клеток в селезенке сингенных мышей. Целью изобретения является повышение чувствительности способа и его упрощение. Цель достигается тем, что проводится инкубация клеток селезенки мышей непосредственно в инкубационной смеси, состоящей из 0,2 М Трис HCL буфера, 150 мМ HCL, 10 мМ MGCL 2, 3 мМ НАДФН, 2 мг/мл инкубационной среды микросом печени мышей и осаждение клеток селезенки после остановки реакции при 1500 об/мин. Разработанный режим позволяет с высокой точностью оценивать иммунотоксичность метаболитов микросомального окисления ксенобиотиков.