Способ получения антигенных детерминант VP @ -белка FMD вируса субтипа О @ К Советский патент 1991 года по МПК A61K39/135 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения антигенных детерминант VPi белка вируса ящура.

Заболевание ящуром является высокоинфекционным, приводящим к обессиливанию заболеванием, которое вызывается вирусом ящура, представляющего собой вирус животных семейства пикорнавирусов.

Способ получения антигенных детерминант вируса ящура предполагает твердофазный синтез пептидов (Цис-Цис (200-213)-Про-Про-Сер(141-158)-Про-Цис-Гли или (200-213}-Про-Про-Сер (141-158)Про- Цис-Гли, или Н-Цис Арг-Тир-Асп-Арг-Асп- Ала (141-158)-Лей-Про-Про-Тре Глу-Ала (200-213)-он.

П р и м е р 1.

I. Получение синтетических вакцин против ЭНР. Все пептиды синтезируют с помощью твердофазного пептидного

синтезатора с использованием полуавтоматического программирования. Все реагенты во всех случаях, за исключением специально оговоренных, являются технически доступными продуктами высшего качества. В качестве дихлорметана применяют продукт (CHaCte) для жидкостной хроматографии с высокой разрешающей способностью. Дии- зопропилэтиламин (ДИЭА) перед использованием перегоняют из нингидрина. Получают сополимерную смолу (1 % стирола и 1% дивинилбензола) в виде шариков с размерами 0,076-0.038 мм.

Качество защищенных аминокислот оценивают тонкослойной жидкостной хроматографией по углу оптического вращения аминокислотным анализом и масс-спект- рографическим анализом.

А. Получение аминометиловой смолы. К тщательно промытой смолы в трехгор- лой круглодонной колбе добавляют 16 г (81

ё

О

о

ГО СО CJ 00

со

ммоль) М-(оксиметил)фталимида и 2 л смеси трифторуксусной кислоты с хлористым метиленом в объемном соотношении 1:1. При интсчсивном перемешивании верхнего слоя осторожно добавляют 40 мл (0,44 моль) трифторметансульфокислоты. По истечении 6 ч реакции при 22°С раствор профильтровывают и подвергают обильной промывке смесью трифторуксусной кислоты с мети- ленхлоридом в объемном соотношении 1:1, метиленхлоридом, этанолом и наконец вновь метиленхлоридом. Сушат в вакууме, смолу кипятят с обратным холодильником в течение 16 ч в 2 л этанола, содержавшего 5% гидразина, отфильтровывают в теплом состоянии и промывают 4 порции по 2 л кипящего этанола, 4 порциями по 2 л мета- нола и 4 порциями по 2 л метиленхлорида. Полученный продукт высушивают в вакууме, Он характеризуется аминовой функцио- нальной активностью 0,836 ммоль/г.

8. Получение бок-глицин- 4-(оксиметил- фенил)-уксусной кислоты. Проводят синтез бок-глицин- 4-(оксиметилфенил)-уксусной кислоты.

C.Присоединение полученного глицина каминометиловойсмоле. 1,4 ммоль бок-гли- 4-(оксиметилфенил)-уксусной кислоты растворяют в 20 мл смеси диметилформамида

с хлористым метиленом в объемном соотно- шении 1:3 при 0°С в присутствии 1,4 ммоль 1-оксибензотризола (ОБТ). Затем добавляют эквивалентное количество (1,4 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) и реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин при 0°С, после чего дициклогексил- мочевину удаляют фильтрованием и верхний слой добавляют к 4 г аминометиловой смолы, суспендируют в 20 мл метиленхлорида, По истечении 2 ч смолу отфильтровыва- ют, трижды промывают с использованием 40 мл метиленхлорида, а затем суспендируют в 40 мл смеси 0,5н. уксусного ангидрида с 0,1 М ДИЭА и метиленхлоридом. По истечении еще 2 ч смола становится нингидрин- отрицательной. Далее смолу трижды промывают 40 мл метиленхлорида, после чего трет-бутилоксикарбонильную защитную группу удаляют в 40 мл смеси трифторуксусной кислоты с метиленхлоридом в объемном соотношении 1:1.

D.Протокол повторяющегося постадий- ного синтеза. В каждом случае используют двойное сочетание каждой аминокислоты в трехкратном избытке амина, Хотя Асп, Гли и Apr подвергнуты двукратному сочетанию

в виде их предварительно полученных ОБТ- эфиров, остальные аминокислоты вначале подвергают сочетанию в виде их предварительно полученных ангидридов и повторяют

в виде их предварительно полученных ОБТ- эфиров. Нейтрализацию, удаление защитных групп и весь процесс промывки проводят полностью автоматически в соответствии с нижеследующим протоколом в 15 мл растворителя на 1 г исходной смолы.

(2x2 мин).

(6x1 мин). (1 х 120 мин).

(6 х 1 мин). (2x2 мин).

(6x1 мин). (1 х 120 мин).

(6 х 1 мин).

(1x2 мин, 1 х 20 мин).

(6 х 1 мин).

В процессе синтеза для получения укороченных иммуногенов удаляют аликвоты смолы.

Е. Получение OiK, VPi (141-158)-Про- Цис-Гли-пептид с 21 остатком.

Приблизительно 3 г пептидиловой смолы, содержащей 1,34 г защищенного 0|К, VPi (141-158)-Про-ЦисТли, обрабатывают 30 мл смеси фтористого водорода с п-крезо- лом в соотношении 9:1 при температуре0°С в течение 60 мин. После завершения реакции отщепления смолу выпаривают досуха в вакууме при 0°С, после чего промывают 5 порциями по 50 мл диэтилового эфира. Освобожденный от защитных групп пептид растворяют с последовательными обработками уксусной кислотой: 10%-ная уксусная кислота (3 порции по 30 мл), 50%-ная уксусная кислота (1 порция 30 мл) и 10%-ная уксусная кислота (3 порции по 30 мл). Пеп- . тид сушат вымораживанием с 76-ным выходом. Титрование по Эллману показывает, что минимальное содержание свободных сульфогидрильных групп составляет 70%. Этот пептид чистят с использованием гель- проникающей хромотографии на смоле Се- фадекс G-25 в 10%-ной уксусной кислоте, после чего подвергают дитиотреитоловому (ДТТ) восстановлению, получая исключительно гомогенную мономерную фракцию, как это устанавливают жидкостным хрома- тографическим анализом с высокой разрешающей способностью.

F.Получение OiK, VPi Лей-Про-Про-Сер (141-158)-Про-ЦисТли пептид с 25 остатками.

Приблизительно 1,1 г пептидиловой смолы, которая содержит 0,532 г защищенного OiK, VPi Лей-Про-Про-Сер (141-158) Про-Цис-Гли , обрабатывают аналогично вышеизложенному в части Е, в результате чего получают с 84%-ным выходом целевой пептид.

G.Получение OiK, VPi (200-213)-Про- Про-Сер (141-158)- пептид с 38 остатками.

Приблизительно 2,4 г пептидиловой смолы, содержащей 1,29 г защищенного OiK, VPi (200-213)-Про-Про-Сер (141-158) Про-Цис-Гли, обрабатывают аналогично изложенному в части Е, в результате чего с 97%-ным выходом получают целевой пептид.

Н. Получение OiK, VPi Цис-Цис (200- 213)-Про-Про-Сер (141-158)-Про-Цис-Гли пептид с 40 остатками.

Приблизительно 2,5 г пептидиловой смолы, которая содержит 1,39 г защищенного OiK, VPi Цис-Цис (200-213 Про-Про-Сер (141-158)-Про-ЦисТли обрабатывают аналогично изложенному в части Е, в результате чего целевой пептид получают с 97%-ным выходом.

Получение OiK, VPi Н-Цис- Агр-Тир-Асп- Арг-Асп-Ала (141-158)-Лей-Про-Про-Тре Глу-Ала (200-213)-он-пептид с 45 остатками.

Защищенную OiK VPi Н-Цис - Арг-Тир- Асп-Арг-Асп-Ала-{141-158)-Лей-Про-Про-Тре Глу-Ала (200-213)-пептидиловую смолу обрабатывают аналогично вышеизложенному в части Е, в результате чего получают пептид, указанный в заготовке данной части примера.

П р и м е р 2. Химическое присоединение пептидов к KLH через СПДП.

Максимально целесообразный уровень нагрузки KLH М-сукцинимидил-3-(2-пири- дитно)-пропинатом (СПДП) определяют в соответствии со степенью осаждения комплекса, которая достигается в течение 60 мин реакции. Устанавливают, что 250-молярный избыток СПДП в соотношении KLH являлся оптимальным, 0,5 г KLH (примерно 1 ммоль) растворяют в 25 мл 0,1 М раствора вторичного фосфата натрия (рН 7,2) при осторожной обработке ультразвуком. Небольшое количество нерастворимого материала удаляют центрифугированием и в верхний слой добавляют 7,81 мг СПДП (2,5 х 10 ммоль) в 625 мкл ДМФ. После прекращения поглощения щелочи образец центрифугируют и обессоливают верхний слой на Сефадексе G-25 в 0,1 М растворе вторичного фосфата натрия при рН 7,2 и скорости 20 см/ч. Устанавливают, что уровень нагрузки, достигнутый в процессе образования произ- водного, составляет приблизительно 40% по ДТТ-восстановлению.

К 100 мг функционализованного KLH (2 х 106 лиганда) в 25 мл 0.1 М раствора вторичного фосфата натрия (рН 7,2) добавляют

0 десятикратный избыток (44 мг) (141-158)- Про-Цис-Гли восстановленного пептида в 600 мкл 0,1 М триметилоламинометила (рН 7,4). За ходом реакции следят по высвобождению лиганда, которое практически ко5 личественно завершается втечение 60 мин при 22°С. Образец обессоливают на смоле Сефакрил S-200 в 0,1 М растворе бикарбоната аммония (рН 7,5) и лиофилизируют. Выход пептидов с 21, 25 и 38 остатками в

0 пересчете на лимитированный реагент составляет, соответственно, 84, 85 и 68%.

Приготовление композиций на основе пептидов.

Все пептиды и продукты сопряжения

5 пептид-KLH растворяют в 10 мкМ тримети- лоаминометана (рН 8,0) до желаемой концентрации, после чего разбавляют в соотношении 1:1 комплектной вспомогательной добавкой Фрейнда. Общий объем,

0 а также концентрация антигена, вводимого каждому животному, описаны для каждого эксперимента.

II. Биологический протокол.

А. Вакцинация морских свинок. В ходе

5 проведения всех экспериментов используют самок морских свинок весом 450-500 г. Каждый вакцинный препарат вводят в организм в указанной дозировке подкожной инъекцией в объеме по 0,15 мп на каждого члена

0 группы морских свинок из пяти животных. Единственным исключением относительно указанного общего объема дозы 0,15 мл является доза объемом 0,45 мл, которую используют при антигенном дозировочном

5 титровании для достижения наивысшей установленной концентрации. Контрольную вакцину готовят с использованием штамма Oi Kanfbenren, являющегося единственным, по которому были опубликованы данные о

0 последовательности. Вакцину готовят с использованием алюминия гидроокисного геля, причем она содержит 1,66 мг сапонина на каждую дозу. Каждой из пяти морских свинок вводят подкожной инъекцией по 1 мл

5 вакцины. В качестве вирусного возбудителя, как указано выше, используют штамм 0| Kanfbenren, В процессе вирусного титрования-проводят разбавление 1/20 с целью получить дозу заражения инфекционных 3000 доз на каждое животное. Всех подопытных животных заражают вирусом подкожным введением в подушечку левой задней лапы в объеме 0,02 мл. Каждую зараженную морскую свинку наблюдают в течение последующих 7 дн, следя за развитием вторичных или общих поражений другой задней ноги или передних ног и рта. Критерием защиты служит отсутствие ка- ких-либочвторичных поражений.

B.Вакцинация крупного рогатого скота. Для всех экспериментов используют телок в возрасте от 6 до 8 мес, весивших приблизительно по 150-180 кг, смешанного разведения, которые характеризуются восприимчивостью к заболеванию ног и рта. Каждый вакцинный препарат вводят в организм в указанной дозировке путем подкожной инъекции в объеме по 3 мл каждому члену группы из трех животных. В каждом эксперименте группу из трех животных не подвергают вакцинации (контрольные животные). Всех животных заражают подкожным введением в язык 104 Dso свежетитрованных вирусов OIBFS в объеме дозы 0,1 мл в десяти точках языка. После заражения животных ежедневно осматривают для выявления повышения температуры тела и развития поражения языка и ног. Животные считаются защищенными от заболевания при отсутствии развития каких-либо вторичных поражений по истечении семи дней после их заражения.

C.Определение титров нейтрализации сыворотки (ГНС). Для количественной оценки титров нейтрализации сыворотки титры антител ELISA определяют как направленные против пептида 140-160. Во всех вак- цинация-х с использованием описанных пептидов достигнута крайне тесная взаи мосвязь между результатами определений ELISA и титрами нейтрализации сыворотки,

III. Биологические результаты.

-

Наиболее убедительным методом определения относительной потенции ряда синтетических пептидных вакцин является метод определения их минимальной за5 щитной молярной дозировки. Анализ пока- зывает заметное улучшение титров нейтрализации сыворотки и защиты для пептидов с 38 и 40 остатками в сравнении с аналогичными результатами, которые до10 стигаются при использовании пептида с 21 остатком.

Пептиды с 38 и 40 остатками являются эквивалентными, если о них судить в-преде- лах погрешности эксперимента, вследствие

15 чего сводится к минимуму значение аминокислотных концевых цис-цис-остатков в молекулах последних. Оба эти пептида обеспечивают, по-видимому, полную защиту в дозировке, которая составляет менее

20 0,1-0,001 дозировки антигенного пептида с 21 остатком.

При молярной дозировке, сопоставимой с той, которая обеспечивает защиту посредством пептида с 21 остатком в

25 комплектной вспомогательной добавке Фрейнда, пептид с 40 остатками обеспечивает полную защиту с комплектной технически доступной добавкой гидрата окиси алюминия. Абсолютный вес антигена, обес30 почивающего полную защиту морских свинок с использованием этой последней вспомогательной добавки при однократной вакцинации, составляет менее 1 мг.

35 Формула изобретения

Способ получения антигенных детерминант VPi-белка FMD вируса субтипа 0|К, включающий твердофазный синтез пептидов, о т- личающийся тем, что осуществляют синтез 40 пептидов Цис-Цис (200-213)-Про-Про-Сер (141-158)-Про-Цис-Гли, или (200-213)-Про- Про-Сер (141-158)-Про-Цис-Гли, или Н-Цис Apr-Тир-Асп-Арг-Асп-Ала (141-158)-Лей- Про-Про-Тре Глу-Ала (200-213)-он.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения антигенных детерминант VP_I-белка FMD вируса. Способ получения антигенных детерминант вируса предполагает твердофазный синтез пептидов со следующей структурой [Цис-Цис(200 - 213)-Про-Про-Сер (141 - 158)]-Про-Цис-Гли, или [(200 - 213)-Про-Про-Сер (141 - 158)-Про-Цис-Гли, или Н-Цис [Арг-Тир-АСп-Арг-Ала (141 - 158)-Лей-Про-Про-Тре [Глу-Ала (200 - 213)]-он.