Бессывороточная питательная среда для культуры ткани Советский патент 1993 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к области биохимии, в частности к области культуры ткани.

Настоящее изобретение охватывает способ выращивания клеток млекопитающих животных в не содержащей сыворотки среде культуры ткани, в котором клетки способны к росту в культуре ткани и имеют положительную реакцию на присутствие инсулина в среде культуры ткани, где среда культуры ткани содержит примерно от 0,1 до 10000 нанограммов аргинил-А-0-инсулина на миллилитр.

Настоящее изобретение охватывает также не содержащую сыворотки среду для разведения пригодную для роста клеток млекопитающих в культуре ткани, которая содержит примерно от 0,1 до 10000 нанограммов аргинил-А-0-инсулина на миллилитр.

Отличительной особенностью данного изобретения является использование арги- нил-А-О-инсулина (ААО-инсулина) как агента улучшения роста клеток млекопитающих

в среде культуры ткани. ААО-инсулин является побочным продуктом процесса получения человеческого инсулина (HI) из человеческого проинсулина. Данный процесс опубликован в имеющейся литературе более подробно, и в качестве исходного продукта используется человеческий проинсу- лин, ковалентно связанный с расщепляемой главной последовательностью, которая синтезируется посредством микроорганизмов, генетически модифицированных для данной цели. Проинсулин расщепляется трипсином и кдрбоксипептидазой В, предпочтительно в присутствии металлических ионов.

Как уже сейчас хорошо известно, человеческий инсулин состоит из 30-аминокис- лотной цепи В, связанной с 21-аминокислотной цепью А посредством дисульфидных мостиков, которые связывают цистеины в положении А-7 и В-7. и цис- теины в положении А-20 и В-19. Человеческий проинсулин является белком, содержащим 86 аминокислот, в котором

сл

с

оо

00

о о

00

о

GJ

глицин в положении А-1 человеческого инсулина (HI) связан стреонином в положении В-30 посредством внутреннего связывающего пептида, 35-аминокислотной цепи. Этот связывающий пептид удаляется путем расщепления в процессе, в ходе которого человеческий проинсулин превращается в HI.

Этот процесс расщепления безусловно не является идеально эффективным, и в результате неполного расщепления образуются некоторые побочные продукты. Одним таким побочным продуктом является арги- нил-А-0-инсулин, который отличается от НГ тем, что имеет одну нижнюю аргинильную группу, присоединенную в положении А-1 к концевой аминогруппе, человеческого инсулина. Этот побочный продукт может быть отделен от HI путем катинообменной хроматографии, как показано ниже в Приготовлении препарата 1. Интересен тот факт, что ААО-инсулин является менее эффективным, чем HI в отношении эффектов снижения глюкозы в крови в условиях ин виво у кроликов. При проведении испытания на кроликах определено, что ААО-инсулин проявляется 75% эффективности, моль на моль, от самого HI. Однако, ААО-инсулин имеет, по меньшей мере, такую же эффективность, как и инсулин в стимулировании роста клеток в культуре ткани. При первых работах биологов и биохимиков по выращиванию клеток млекопитающих в культуре ткани было принято выращивать их в среде культуры ткани, содержащей кислотную сыворотку в пределах концентрации от 5 до 10%. Сыворотка служила в качестве ценного питательного сырья для клеток, и многие очень важные эксперименты проводились в таких культурах. Однако желание в более точных экспериментах привело к выращиванию клеток культуры ткани в специфической среде, в которой все составляющие компоненты очищены и имеют точные характерные для них химические названия. Одним из таких веществ, которое может или должно вводиться в специфическую среду для желаемого роста многих клеток, является инсулин.

Так например, в литературе описаны следующие типы клеток, как положительно реагирующих на ввод инсулина в среду культуры ткани.

Карцинома гипофиза крысы Человеческая цервикэльная карцинома Карцинома собачьей почки Крысиная нейробластома Мышиная меланома Крысиная глиома

Карцинома человеческой молочной

железы

Яичник крысы

Эмбриональная мышиная карцинома Мышиные семенники

Карцинома человеческой толстой кишки

Мышиные эмбрионы Balb/c

Крысиный мирбласт

Эпидермоидная карцинома 0 человеческого легкого

Почка хомяка

Человеческий фибробласт

Человеческая эпидермоидная

карцинома 5- Крысиная щитовидная железа

Мышиный эмбрион

Мышиная лимфома

Овечий адиноцит

Инсулин является общим необходимым 0 или желательным фактором в среде для выращивания клеток млекопитающих. Исполь- зование настоящего изобретения желательно в культурах всех клеток млекопитающих, которые стимулируются инсули- 5 ном в среде разведения культуры. Так, природа или источник клеток, которые должны использоваться, не является ограничивающим фактором при осуществлении данного изобретения. Среда культуры ткани 0 также не является ограничивающим фактором. Ранее уже была тщательно изучена не содержащая сыворотки среда культуры ткани, и в литературе были опубликованы данные работы на 30 лет или более. Для 5 информации можно привести нижеследующие источники, которые приводятся здесь как ссылочный материал,

Обычно не содержащая сыворотки питательная среда выращивания клеток мле- 0 копитающих приготавливается из многочисленных ингредиентов, включающих основные аминокислоты, такие как аргинин, цистеин, гистидин, метионин и другие: неосновные аминокислоты, такие 5 как аланин. аспарагин, глицин, и другие; и аминокислотные производные, такие как глютатион. оксипролин, путросцин и другие. Обычно они содержат такие витамины, такие как фолиевая кислота, биотин. никоти- 0 намид, пантотеновая кислота, пиридоксин, рибофлавин и витамин В12. Часто используются углеводы, такие как глюкоза и пируват, а также производные нуклеиновой кислоты, такие как аденин, гипоксантин и тимидин. 5 Такая питательная среда выращивания содержит источник липидов, например холин и и-инозитол, и неорганические ионы, включая ионы кальция, магния, натрия, фосфата и другие. Часто она включает неорганические элементы в следовых количествах, например кобальт, железо, селен, цинк. Часто питательная среда выращивания приготавливается в форме буферного раствора для поддержания желаемого значения рН, часто с использованием бикарбонатного иона или газообразной двуокиси углерода. Как разъяснялось выше, ААО-инсулин является побочным продуктом процесса получения HI из человеческого проинсулина, и согласно этому он легко получается для использо- вания в настоящем изобретении путем простого извлечения из продукта загрязненного HI.

Нижеследующий раздел Приготовление препарата 1 иллюстрирует процедуру хроматографического разделения, используемую для этого извлечения, и этап кристаллизации с целью очистки ААО-инсулина.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТА 1

ХРОМАТОГРАФИЯ

Смесь, содержащая ААО-инсулин и HI, растворяется в 32 мл буферного раствора, с концентрацией 7 моль мочевины. 0,05 моль ацетата натрия и 0,1 моль хлорида натрия, величина рН 3,8. Хроматографическая колонка размерами 1x15 см наполняется суль- фопропиловой ТРИЗАКРИЛ смолой, изготавливаемой фирмой Reactib IBF, отделением Rhone-Poulenc с размером частиц 40-80 мкм. Раствор ААО-инсулина вводится в колонку и элюируется градиентным буфером (в количестве, составляющим 9-кратный обьем колонки) того же состава, что описан выше, с той разницей, что концентрация хлорида натрия в нем увеличена до 0,2 моль. Скорость прохождения в колонке составляет 1 мл/мин. Поток продукта, выходящего из колонки, контролируется по спектру поглощения при 280 нм. Инсулин выходит из колонки первым, он практически весь элюируется в первых 70 мл после начала градиентного элюирования. Затем выходит ААО-инсулин, который собирается в выходящей фракции 72-105 мл для получения фракции, обогащенной ААО-инсулином с очень небольшой примесью HI.

КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ

Величину рН раствора ААО-инсулино- вого продукта в количестве 840 мл (с содер- жанием2,32 г ААО-инсулина) доводят до 8,0 посредством 10%-ного гидрата окиси натрия. Раствор концентрируется до объема 260 мл при 4°С с использованием отсасывающей молекулярной массой 3000. Концентрированный раствор затем диафильтруется с использованием 280 мл деионизированной воды. Раствор разбавляется до концентрации 2 г белка на 1 л. В него добавляют 16,2 мл ледяной уксусной кислоты и 850 мл деионизированной воды, так чтобы концентрация уксусной кислоты данного раствора составляет 0,25 моль. Затем он нагревается до 23°С, в него вводится 0,93 мл 20%-ного водного раствора хлорида цинка. Величина рН доводится до 6,0 посредством концентрированного раствора гидрата окиси аммония. Смесь перемешивается в течение 4 ч при 23°С. Затем она охлаждается до 4°С, а смесь инкубируется при указанной температуре в течение 16ч без перемешивания. Затем поверхностный слой декантируется, а оставшийся густой кристаллический шлам центрифугируется. Кристаллы промываются двукратно очищенной водой, затем двукратно абсолютным этанолом, используемым в количестве 23 мл на каждую промывку. Кристаллы высушиваются в вакууме при комнатной температуре, и в результате получается 2,11 г практически чистого ААО-инсулина.

Пример. Используется ААО-инсулин для роста клеток яичника Китайского хомяка в не содержащей сыворотки среде, которая. как было показано, эффективна для роста таких клеток. Эта среда состоит из трех частей модифицированной Dulbecco среди Eagle (ДМЕ)и одной части (по объему) среды П2, с введенными в нее селеном (10 8 моль) этаноламином (50 мкмоль), оксиэтилпипера- зинэтансульфокислотой(20 ммоль)и человеческим трансферрином (1 мкг/мл). Количества ААО-инсулина, которые указаны в нижеследующей таблице, вводятся в различных пропорциях от количества среды. Клетки выращиваются в 12-ячеистых чашках Конинга, которые предварительно обрабатываются ламинином, белком, который способствует прилипанию клеток и распределению их в ячейках разведения культуры. Эксперимент для каждого условия осуществляется двукратно, Каждая ячейка с питательной средой разведения инокулируется 25000 клетками на 0-й день эксперимента, и подсчет осуществляется на 6-ой день с помощью счетчика Колтера. В данных экспериментах используются четыре различных партии ААО-инсулина. Концентрации ААО-инсулина, вводимого в питательную среду разведения в виде раствора в 0,1 н. соляной кислоте, выражаются в нанограммах на миллилитр во всех случаях. В контрольных экспериментах без ввода инсулина или ААО-инсулина в среду разведения, число клеток составляет от 10000 до 200000 на ячейку. Те же клетки в той же среде, содержащей HI или коровий инсулин вместо ААО-инеулина, растут так же, как и в описанных здесь экспериментах.

Приведенные выше экспериментальные данные показывают эффективность ААО-инсулина в стимулировании роста клеток, которые реагируют на инсулин в культуре ткани, Среднее число клеток на ячейку в этих испытаниях увеличивается от 240000 до 610000 в зависимости от концентрации ААО-инсулина:

Формула изобретения Бессывороточная питательная среда для культуры ткани, содержащая основную среду и стимулятор роста клеток, отличающаяся тем. что в качестве стимулятора роста она содержит аргинил А-0 инсулин в концентрации 0.25-100 нг на мл.

Использование: биохимия, культура ткани. Сущность изобретения: для реализации изобретения в не содержащую сыворотки среду культуры ткани вводится Аргинил-А- 0-инсулин. побочный продукт биотехнологического синтеза человеческого инсулина из человеческого проинсулина для стимуляции роста клеток млекопитающих животных, которые положительно реагируют на инсулин в культуре ткани. 1 табл.