Способ получения конъюгата гидразона Советский патент 1990 года по МПК C07D519/04 G01N33/53 

Изобретение относится к способу получения новых коньюгированных производных винбластиновых алкалоидов, он

r.f.,cii2-CH3

а именн формулы

Н

он

а именно конъюгата гидрачона общей формулы

.,cii

Н

Изобретение касается коньюгированных производных винбластиновых алкалоидов, в частности получения коньюгата гидразона общей формулы @ , где R=OCH₃ или NH-N=HC-

R₁=H или C[O]-[CH₂]₂-C[O]-NH-N=CH-

M= 1-10, причем R≠NH-N=CH-, когда R₁=C[O]-[CH₂]₂-C/O/NH-N=CH-, а R₁≠C[O]-[CH₂]₂-C/O/NH-N=CH- когда R=NH-N=CH

GP - остаток иммуноглобулина или его фрагмента, обладающих противоопухолевым действием, что может быть использовано в медицине. Цель - создание новых более активных веществ указанного класса. Синтез ведут взаимодействием соответствующего винка-гидразина, где R=HN-NH₂ или OCH₃

R₁=H или C[O][CH₂]₂C[O]NH-NH₂, причем R≠NH-NH₂, когда R₁=C[O][CH₂]₂-C[O]NH-NH₂, и R≠C[O]-[CH₂]₂-C[O]-NH-NH₂, когда R=NH-NH₂, с альдегидной группой окисленного иммуноглобулина или его фрагмента. В этом случае гидразидный коньюгат при дозах 3 - 0,375 мг/кг обеспечивает подавление роста опухоли, в то время как с известным гемисукцинатным коньюгатом не происходит полного подавления роста при дозах до 10 мг/кг винка-эквивалента. 6 табл.

| рС-ОСНз Н I 6

.нCHjO

-CHj-CH, j СР ,, ORi сн он

CHjr COR

где R

ъ

m

ОСИ, или - NHN CH-rpynna; Hi - COClI9.CHe-CONHN CH-rpynna 1-10, причем R не может быть - NHN CH-, когда 11/-( CO(CH2)ZCONHN-CH-, a R не может быть CO(CK.t)2CONHN-CH- когда R - NHN-CH-, GP - остаток иммуноглобулина или его фрагмента,

обладающих противоопухолевым действием.

Цель изобретения - получение новых конъюгатов гидралона, обладающих фармакологическими преимуществами перед конъюгированными аналогами.

П р и м е р 1. Получение 4 -деок- си-4-дезацетиллейрозидин-З-карбокси- гидразид-N2-сукцинимида.

Раствор готовят из 1320 мк 4 -де- окси-4-дезацетиллейрозидин-З-карбок- сигидразида в 25 мл пиридина. 175мг ангидрида янтарной кислоты прибавляют к раствору и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в атмосфере азота примерно в течение 24 ч. Затем из реакционной смеси в вакууме удаляют петучие компоненты, а образующийся осадок поглощает метилендихлорид в комбинации с достаточ- 30 образом №-глутароиловый 4-дезацетилным количеством метанола для полного растворения полученного осадка. Органический слой дважды промывают равным по объему количеством воды, а затем высушивают. При упаривании летучих компонентов в вакууме получают осадок, содержащий М2-сукциноил 4 - деокси-4-дезацетиллейрозидин-3-кар- боксигидразин, который растворяют в

25 мл пиридина, к которому прибавлено до ацетил-УЬВ-З-карбоксигидразид-К2350 мг ангидрида уксусной кислоты. В результате образуется смешанный ангидрид янтарной и уксусной кислот, который одновременно циклизуется, давая 4 -деокси-4-дезацетиллейрозидин- 45 З-карбоксигидразид-N2-сукцинимид. Реакционную смесь упаривают досуха в вакууме, а полученный осадок растворяют в метилендихлориде. Экстракт метилендихлорида промывают дважды 50 равным по объему количеством воды, а затем высушивают. При упаривании двух- хлористого метилена получают 4 -деок си-4 дезацетиллеярозидин-3-карбокси,

глутаримида. Указанное соединение очищают хроматографией на силикаге с использованием указанной системы растворителя. Получают 460 мг №-г таримидного производного, которое имеет следующие физические характе ристики:

Масс-спектр, п/е 864 (C48H60N

ИК-спектр (СНС19): 3475; 1714 и 1616 см-1 .

рКа (66%-ный водный раствор ДМФ DMF): 5; 1,7; 12,9.

ЯМР (CDC13): 9,9b; 8,91; 8,04;

гидразид-М2-сукцинимида, который хро- 55 7,52; 7,14; b,58; b,08; 5,83; 4,15;

матографируют на колонке из силикаге- ля этилацетатом, содержащим в качестве элюента возрастающие количества метанола (0-50%). Фракции, которые

3,78; 3,69; 3,Ы; 2,8Ь; 0,93; 0,89. Сульфатную соль получают по указанному методу. Из 290 мг исходного материала получают 210 мг соли.

na; 5 - аЮ

15618254

(как установлено тонкослойной хроматографией) содержат требуемое сукцини- мидное произвоцное, соединяют и выпаривают в вакууме твердое вещество. Получено 190 мг 4 -деокси-4-дезацетил- лейрозидиН-З-карбоксигидразид-Н-сук- цинимида со следующими физическими характеристик ами:

ИК-спектр (в хлороформе): 1736; 1615 и 1572 .

ЯМР (CDC13): 10,90; 7,88; 7,49;

7,12; 6,48; 6,Ob; 5,80; 4,10; 3,76; 3,ь6; 2,82; 0,93:, 0,85.

Сульфатную соль получают путем растворения свободного основания в безводном этаноле при ,0„ Затем рН устанавливают 3,9, используя свежеприготовленный раствор 2%-ной серной кислоты в этаноле. При упаривании реакционной смеси досуха получают 4 -деокси-4-дезацетиллейрозидин-3- карбоксигидразид-N2-сукцинимидный сульфат.

Следуя указанной методике, ацетилвинбластиновый гидразид (2,4 г) растворяют в 125 мл пиридина, к которому прибавлено 385 мг ангидрида глу- таровой кислоты. Полученный таким

5

VLB-3-карбоксигидразид выделяют по указанной методике и очищают хроматографией на силикагеле с использованием аналогичной системы растворителя, как описано выше. Полученное глута- роильное соединение взаимодействует с ангидридом уксусной кислоты, образуя смешанный ангидрид, который одновременно циклизуется с выходом 4-дезглутаримида. Указанное соединение очищают хроматографией на силикагеле с использованием указанной системы растворителя. Получают 460 мг №-глу- таримидного производного, которое имеет следующие физические характеристики:

Масс-спектр, п/е 864 (C48H60N60,)

ИК-спектр (СНС19): 3475; 1714 и 1616 см-1 .

рКа (66%-ный водный раствор ДМФ DMF): 5; 1,7; 12,9.

ЯМР (CDC13): 9,9b; 8,91; 8,04;

7,52; 7,14; b,58; b,08; 5,83; 4,15;

3,78; 3,69; 3,Ы; 2,8Ь; 0,93; 0,89. Сульфатную соль получают по указанному методу. Из 290 мг исходного материала получают 210 мг соли.

Следуя указанному методу, но рпять заменяя 4-дезацетил У1,В-3-кар боксигидразид на 4 -деокси-4-дезаце- тиллейрозидин-J-карбоксигидразид, используя вместо ангидрида уксусной кислоты хлористый ацетил, получают М2-сукциноил 4-дезацетил- VLB-3-карбоксигидраэид, При хроматографии сукцинимидного продукта выходит две фракции, одна из которых представляет ожидаемый 4-дез-- ацетил УЬВ-3-карбоксигидразид-№- сукцинимид, а другая - его 4-ацетил- производное, образуемое в качестве побочного продукта во время процесса циклизации. 4 дезацетил ГЬБ-3 карбо- ксигидразид-Ы2-сукцинимид имеет следующие физические характеристики:

Масс-спектр, (,) .

ИКгспектр (КВг): 3480; 1734 и 1616 .

ЯМР (С1)С13): 9.69; 9.47: 8,22; 7,49; 7,12; 6,53; 6,07; 5,82; 5,71; 4,01; 3,77; 3,63; 3,59; 2,84; 2}82 и 0,89.

Сульфатную соль получают по указанному способу. Выход 250 мг из 350 мг исходного материала.

II р и м е р 2. Готовят раствор путем растворения 2$5 г 4-дезацетил- 4-гемисукцината (4-сукциноил-УЬВ) в 50 мл хлороформа. Добавляют 870 мг N-метилморфолина. По завершении растворения реакционную смесь охлаждают в ледяной бане и подают ток азота. Добавляют 985 мг изобутилхлорформата и реакционную смесь перемешивают при О С в течение 45 мин. Добавляют 1 мл безводного гидразина и реакционную смесь перемешивают около 10 мин. Затем реакционную смесь экстрагируют водой, водный слой отделяют и отбрасывают и органический слой сушат. Выпаривание растворителя дает остаток, содержащий 4-дезацетил Л В 4- гемисукцинат гидразид. Раствор остатка в метиленхлориде хроматографируют на силикагеле, используя в качестве элюента смесь этилацетата и метанола 100:0 - 50:50). Сооответствующие фракции дают 950 мг очищенного гидразида 4-дезацетил У1,В-4-гемисукцината; .

Сульфатную соль получают путем растворения основания в безводном этаноле (25 мл), доведения рН примерно до 4 с помощью 2%-ного раствора серной кислоты в этанол (24,5 г безводного этанола, 0,5 г 18 М ) и удаления растворителей в вакууме.

ИК-спектр: 3400; 3009; 1738; 1680 и 1616 см( .

ЯМР (CDC1,): 9,9; 8,35; 8,05; 7,55; 7,10; 6,85; 6,10; 5,85; 5,45; 5,30; 3,80; 3,70; 3,60; 2,70; 0,90; 0,85. Предлагаемые конъюгаты включают

окисленные гликопротеины, предпочтительно иммуноглобулины, и из этого класса предпочтительно моноклональ- ное антитело (МоАЬ), представляющее собой гамма-глобулин, такой как IgC

5 или IgM. Фрагменты иммуноглобулина (ig), содержащие углевод, так же как исходный иммуноглобулин, из которого получают эти фрагменты, могут быть использованы для образования новых

Q конъюгатов такого же типа.

Предпочтительный кла.с гликопротеи- нов (иммуноглобулины) представляет собой соединения, которые реагируют или по крайней мере распознают анти5 гены на клетке-мишени, т.е. они имеют свойства распознавания антигенов. В особенности предпочтительными являются те гликопротеины, которые распознают антигены на поверхности

0 клетки-мишени.

Предпочтительным видом антитела для использования в изобретении явля,- ется иммуноглобулин, представляющий собой гамма-глобулин, В особенности

5 предпочтительными являются виды IgC, IgA, IgE и IgM.

Предпочтительными конъюгатами являются те, которые приготовлены из моноклональных антител, в особеннос0 ти те, что распознают клетки рака человека, такого как аденокарцинома. чешуйчатая клеточная карцинома, переходная клеточная карцинома, меланома, нейробластома, мелкоклеточная карци-

5 нома, лейкемия, лкмфома и саркома.

Гликопротеин (ГП) указанного типа может быть окислен периодатом или другим подходящим окисляющим агентом так, что связь между соседними диола-

ми в поверхностном углеводе разрывается и образуются альдегидные группы по обе стороны исходной связи

I ,

н-с-он

н- с - он

сно сно

тп

Часть структуры углевода диальде- гидный продукт.

Число полученных диальдегидных единиц является результатом следую- щих факторов; количества используемого периодата, общих условий реакций окисления (например, времени, температуры, растворителя, концентрации и т.д.)| числа соседних диодов угле- водных единиц, присутствующих в протеине, и их доступности для периодат- ного реагента.

Альтернативно или в сочетании с периодатом можно использовать фермен- тативное окисление, например, оксида- зой галактозы. Это более селективный и ограничивающий реагент, катализирующий превращение 6-ОН группы остат- ков галактозы в углеводных цепях гли- копротеина в альдегидные группы. Эта 6-CHj OH-rpynna должна быть незамещенной, чтобы обеспечить успешное окисление. Демаскирование блокирующей группы, такой как группа, в которой имеется остаток сиалиновой кислоты, может быть обеспечено с помощью Фермента нейроминидазы. Число получаемых альдегидных остатков является функцией многих параметров.

Альдегидсодержащие гликопротеины (OCH)m-GP затем конъюгируют с винка- гидразидом.

Число m является функцией числа альдегидных групп, возникающих при описанном окислении. Обнаружены конъ- югаты, содержащие 25 винкаостат- ков на антитело. Среднее значение (винкаостатков на антитело) примерно 1 - 10 (т.е. - 10), предпочтитель ное значение примерно 4 - 10.

Конъюгирование винкагидразидов с окисленными гликопротеинами проводится по стандартным методикам. Раствор винкасоединения в растворителе, смешиваемом с водой, таком как диме- тилформамид, добавляют к охлажденному буферному водному раствору окисленного гликопротеина. Предпочтительная температурами - 8°С, обычно исполь- зуют буфер 0,1 н. ацетата натрия. Реакцию лучше проводить в темноте и в инертной атмосфере. Реакция обычно заканчивается за 10 - 24 ч, образующийся конъюгат может быть очищен стандартными методами, таком как хро- матограЛия на сесЬадексе.

Далее следует описание окисления и конъюгирования специфических МоАЬ.

П р и м е р 3. Конъюгирование с X-63AG8-S1 МоАЬ.

Готовят раствор путем растворения 200 мг X-63AG8-S1 (1 мл приблизитель- но 150000, 1 ,34хНГбмоль; клеточная линия депонирована как АТСС 11В9; коллекция культур американского типа, 12301 Parklawn Drive, KockvilJe MD 20852) в 20 мл буфера 0,1 М ацетата натрия, рН 5,6 (29,3 г ацетата натрия, 2,44 мл уксусной кислоты плюс достаточное количество стерилизованной воды для изготовления 4 л буфера) Раствор хранят при 0°С в течение ночи (около 10% протеина не растворяется). Добавляют 685 мг метапериодата натрия за один прием при энергичном перемешивании.

Смесь перемешивают 21 мин при 0°С в темноте и затем гасят реакцию путем добавления 5-кратного избытка (на полное количество периодата)эти- ленгликоля (1,28 мл 12,5 М раствора этиленгликоля в стерильной воде). Новую смесь перемешивают при 0°С в течение 5 мин в темноте и затем центрифугируют, получая прозрачную надоса- дочную жидкость и белый осадок. Надо- садочную жидкость загружают в колонну с гелем сефадекс G25 (средняя зернистость) и продукт элюируют тем же буфером ацетата натрия. Элюат проверяют УФ-облучения при 280 мм. Периодат смывают с колонны и отбрасывают. Концентрацию окисленного продукта оценивают в каждой фракции элюата при 279 нм. Выход 96%. Проведенный так же второй опыт дает 96,5%-ный выход.

Растворы элюата, содержащие 4,72 и 4,02 мг/мл окисленного продукта, смешивают и добавляют буфер 0,1 н. ацетата натрия для получения конечной концентрации протеина 2,77 мг/мл (полный объем 69 мл). Раствор охлаждают примерно до 0°С.

Раствор 4-дезацетил-У1.,В-3-карбоК- сигидразида в ДМФ (5,6 мл и 53,7 мг/мл раствора) добавляют по каплям к охлажденному буферному раствору МоАЬ. Реакционный сосуд промывают, азотом и закрывают. Реакционную смесь перемешивают при охлаждении и в темноте магнитной мешалкой в течение 24 ч. Затем реакционный сосуд . открывают и центрифугируют прозрачную бледно-желтую реакционную смесь. Надосадочную жидкость хроматографиру- ют на геле сефадекс G25, предварит

Антитело

Среднее число молей винка на моль анти- тела в конечном конъюгированном продукте

10

15

тельно уравновешенном до рН 7,4,Таблица1

фосфатно-солевым буфером (0,01 М ,, 0,15 М NaCl). который используют также в качестве элюента.

Конъюгат (образованный гидразон- ной связью мажду 3-карбоксигидразид- ной группой и альдегидной группой в МоАЬ) элюируют сначала с последующим элюированием непрореагировавшего 4- де-зацетил-VLB-3-карбсксигидразнда. Выход полученного конъюгата (из 4 колонн) составляет .73 мг в 224 мл (90%-ный выход). Конъюгат содержит около 6 моль 4 дезацетил- ГЬВ 3.-кар- боксигидразона на моль X-63AG8 - S1 МоАЬ.

Второй опыт проводят, используя 200 мг KS 1/4 МоАЬ, способный к распознаванию поверхностных антигенов клеток (аденокарциномы человека), в 20,0 мл ацетатного буфера и то же количество периодата и этиленгликоля, как в примере 3. Опыт дает 176 мг окисленного MoAb в 39,9 мл буфера после хроматографии (88%-ный выход). Конъюгирование с 274 мг 4-дезацетил- VLB-3-карбоксигидразидом в ацетатном буфере, рН 5,6, дает 146 мг (83%-ный выход) конъюгата, содержаще- 30 пользованных при вычислении среднего.

20

25

11,285.14

11А8

11В2

13Н1

17Й12

2А11

4D12

4Е8.11

6D2

Г9

L1KS

L2KS

L4KS

L6KS

ZCE-025

10

4,2 (3)

11,9 (11)

Примечание. Число в скобках указывает количество опытов, неВ этой группе обнаружен один конъю гат, содержащий около 27 винка-групп на антитело.

го около 7,5 моль 4-цезацетил ЬВ-3- карбоксигидразоча на моль KS 1/4. По указанной методике получают конъюгат путем взаимодействия 4-дез- ацетил-VLB-3-карбоксигидразида с 35 альдегидными группами, образованными окислением поверхностных углеводов 9.2.27 гликопротеина МоАЬ, способного к распознаванию антигенных свойств на поверхности клеток меланомы чело- 40 века. Опыт при использовании 200 мг МоАЬ, окисленного 685 мг метапериода- та натрия в ацетатном буфере при рН 5,6 (0,1 М), дает альдегидсодержащий окисленный 9.2.27 МоАЬ с 92%-ным вы- 45 ходом (184 мг). Этот продукт конъюги- руют с 4 дечацетил У1.,В-3-карбоксигид- разидом (279 мг). Конечный выход по- ли-4-дезацетил У1,В-гидразона окисленВ этой группе обнаружен один конъю гат, содержащий около 27 винка-групп на антитело.

Конъюгаты также могут быть получены с фрагментами иммуноглобулина Ig, мономером IgM или другими мономерами Ig, содержащими углевод, полученными из исходного антитела путем, например, расщепления протеолитичее- ким ферментом или восстановительного алкшшрования, Предпочтительными про- теолитическими Ферментами для получения этих фрагментов являются пепсин и папаин.

Исследование конъюгатов по изобретению может быть проведено, используя известную технику, такую как афин ная хроматограЛия. Действие конъюгата может быть оценено путем подсчета i

ного альдегидсодержащего 9.2.27-конъ- 50 числа жизнеспособных клеток после обработки конъюгатом суспензии опухолевых клеток или путем измерения погло- щения тритированного уридина. Концентрации протеина и лекарственного преюгата в виде раствора в фосфатно-со- левом буфере составляет 91%.

Продукт содержит около 4,9 моль исходного винка на моль 9.2.27.

По методике, описанной в примере 3,55 паРата определяют путем измерения

как представлено в табл. 1, получают несколько других конъюгатов антител, используя 4-дезацетил-VLB-3-карбок- сигидразид в качестве остатка винка.

оптической плотности растворов кон гата при двух длинах волн, наприме 270 и 279 нм, и сопоставления полу ченных значений со значениями для

Среднее число молей винка на моль анти- тела в конечном конъюгированном продукте

5

0 пользованных при вычислени

0

5

11,285.14

11А8

11В2

13Н1

17Й12

2А11

4D12

4Е8.11

6D2

Г9

L1KS

L2KS

L4KS

L6KS

ZCE-025

10

4,2 (3)

11,9 (11)

пользованных при вычислении среднего.

Примечание. Число в скобках указывает количество опытов, непользованных при вычислении среднего.

В этой группе обнаружен один конъюгат, содержащий около 27 винка-групп на антитело.

Конъюгаты также могут быть получены с фрагментами иммуноглобулина Ig, мономером IgM или другими мономерами Ig, содержащими углевод, полученными из исходного антитела путем, например, расщепления протеолитичее- ким ферментом или восстановительного алкшшрования, Предпочтительными про- теолитическими Ферментами для получения этих фрагментов являются пепсин и папаин.

Исследование конъюгатов по изобретению может быть проведено, используя известную технику, такую как афин ная хроматограЛия. Действие конъюгата может быть оценено путем подсчета i

числа жизнеспособных клеток после обработки конъюгатом суспензии опухолевых клеток или путем измерения погло- щения тритированного уридина. Концентрации протеина и лекарственного препаРата определяют путем измерения

оптической плотности растворов конью- гата при двух длинах волн, например 270 и 279 нм, и сопоставления полученных значений со значениями для

свободного лекарственного препарата и неконъюгированного иммуноглобулина при тех же длинах волн. Конъюгат можно- также подвергнуть оценке in vivo против ксенотрансплантантов опухолей человека в атипических мышах.

Новые конъюгаты эффективны в шире- ком интервале дозировок. Например, для лечения взрослых людей, больных раком, дозы обычно находятся в интер- вале 0,01 - 10 мг/кг (остаток винка), чаще всего в интервале 0,03 - 9 мг/кг Однако следует иметь в виду, что личество принимаемого кокъюгата on- ределяется врачом в зависимости от условия и курса лечения.

В следующих таблицах указано-действие предлагаемых конъюгатов при лечении новообразований.

В табл. 2 приведена минимальная эффективная доза (винка эквивалент) в моделях меланомы конъюгата 9.2.27- дезацетил-VLB-гидразида.

Таблица2

ия

ома

М.Э.Д., мг/кг содержание винка

сО,0625 0,375 0,375 0,375 0,185

Примечание. Н.Э.Д. - минимальная эффективная доза, которая демонстрирует 50% подавления роста опухоли в течение 28 дней, конъюгата 9.2.27-дезацетил Л,В-гидразида в пе

О

РЗИ CLA НТ-29 FA1M LS174 РЗИ CLA РЗИ СТА РЗИ CLA РЗИ CLA. LS174 LSI 74

ресчете на содержание винка за трехразовое внутривенное введение (2, 5 и 8 дни после имплантации опухоли).

В табл. 3 показана минимальная эффективная доза (винка эквивалент) в моделях ксенотрансплантантов аденот карциномы конъюгата KS1/4-дезацетил- VLB-гидразида.

Т а б л и ц а 3

VL М.Э.Д. мг/кг содержание винка

РЗ-ИСЬД - карцинома легкого

человека :0,0625 НТ-29 - колорек- тальная карцинома 0,25 НТ-29 VTE - ко- лоректальная карцинома(),25

М.Э.Д. -минимальная эффективная доза, которая демонстрирует 50% подавления роста опухоли, конъюгата KS1/4-дезацетил-УЬВ-гидразида в пересчете на содержание винка за трехразовое внутривенное введение (2, 5 и 8 дни после имплантации опухоли).

HT-29VTE представляет собой отобранный in vivo вариант клеточной линии, устойчивый к терапии винка алкалоидами.

В табл. 4 показана минимальная эффективная доза конъюгатов монокло- нального антитела 4 дезацетил-У1,В- гидразида в моделях человеческих опухолей на мышах. i

Таблица4

Oj05 0,0625 0,5 0,3 0,125 0,125 1,2 0,6 ,5 0,5

То же, что в табл. 2 и 3. Винка-содержимое конъюгата - 4-дезацетнлVLB-гидразид.

РЗИ CLA - аденокарцинома легкого; НТ-29 - адено- карцинома толстой кишки; FADIi - глоточная чешуйчатая клеточная карцинома; LSI 74 - аденокарци- нома толстой кишки; Т222 - клеточная карцинома. Животным вводили конъюгат три раза в период

2- 8 дней после имплантации,опухоли. Опухоли измеряли 28 дней после имплантации, Ингибирова- ние определяли по отношению к животным, обработанным PbS в качестве контрольных.

Использовался тот же протокол, что в 1), но дозу вводили на 3, 6и9 дни и опухоли измеряли через 2,

3или 4 недели.

В опыте голые мьши были заражены клетками РЗИ CLA аденокарциномы человеческого легкого путем подкожного введения в день 0. На 2, 5 и 8 день после этого группы по четыре или пять животных подвергали обработке путем рнутривеиного введения либо конъюга- та либо описанного винка-- производного. На 28-й день измеряли опухоль

Лекарство

Т

Доза, мг/кг I Процент подавления

мг/кг винка или содержание винка.

Продолжение табл.4

и определяли процент подавления путем сравнения массы опухоли обработанных групп животных с необработанными . контрольными животными. Доза выражена в мг/кг содержания винка в конъюгате.

Результаты эксперимента приведены в табл. 5.

В табл. 5 показан опыт с аденокар -. ционной РЗИ CLA.

Т

Таблица5

I Процент подавления

В табл. 5 ДАВЛБтидразнд представ ляет собой 4-дезацетилвинбластин-З- карбоксигидразид, как приведено в британской заявке на патент f OB 2 090 83/А, тогда как конъюгат ДАВЛБ- гидразида - KS1/4 представляет собой конъюгат, полученный согласно методике, описанной в примере 3,

Как видно из приведенных данных, в основном полное подавление роста опухоли наблюдалось при уровнях дозировок конъюгата 1„0 мг/кг, тогда как при том же уровне свободный ДАВЛБ- гидразид проявлял только минимальное действие. Таким образом, эксперимент показывает, что лекарство - конъюгат иммуноглобулина согласно изобретению имеет очевидные преимущества по срав-- нению со свободным лекарством в конь- югированной форме.

Аналогичным образом сравнение этого же конъюгата с конъюгатом с тем же антителом, но приготовленным так, как описано в патенте СССР If 1362404, т.е. конъюгат сукцината, известный как конъюгат-4-дезацетилвинблаетин- 4-гемисукцината с антителом KS1/4, проведено по той же схеме, которая описана в табл. 5, но в человеческой колоректальной аденокарциноме. Измерение опухоли произвели на 35-и день. Результаты приведены в табл. Ь.

В табл.6 дана колоректалъная аденокарцинома НТ-29 человека.

Т а б л и и аб

Лекарство

Доза, мг/кг

Процент подавления

10,0

5,0 2,5, 1,25

3,0

1,5

0,73 0,375

25

18

О

100 97

100 100

мг/кг винка или содержание винка. Как видно из полученных данных, гемисукцинатный конъюгат при дозах до 10 мг/кг винка эквивалента показал в лучшем случае только умеренную активность, которая не приблизилась к

полному подавлению роста опухоли, а предлагаемый гидразидный конъюгат показал в основном подавление роста опухоли при дозах 3 - 0,375 мг/кг.

Таким образом, эксперимент показывает большую биологическую активность предлагаемых конъюгатов по сравнению с конъюгатами сравниваемого винка и антитела, конъюгированных другим способом. Конъюгаты проявляют среднюю токсичность, но обладают большим терапевтическим индексом, чем известные лекарства и конъюгаты, применяемые для лечения раковых заболеваний, и могут быть эффективно применены для лечения раковых больных.

Формула изобретения

Способ получения конъюгата гидра- зона общей формулы

ОН

-ify-CHrCHj

и

GP

СНг-СН3 ORi

i Гон

сн3| ,т

COR

где R - ОСН3 или -ЫН СН-группа;

R, - Н. COCHiCH2 -CONHN CK-rpynna;

m 1-10, причем R не может быть , когда R, - СО(СН2)2 CONHN - СН-, а К, не может быть CO(CHZ)4CONHN-CH-, когда R - NHN-CH-, GP - остаток иммуноглобулина или его фрагмента, .

отличающийся тем, что винка-гидразин общей Аормулы II

50

СНг-СН3

Снг-СН3

СН30

17 156182518

где R - NHNHj группа или ОСН3, H, когда R представляет собой

или CO(CHZ)2C()NHNH2, причем NHNH2

Rjrfe является NHNH2, когдаподвергают взаимодействию с альдеR, - CO(CH2)2CONHNH2 и R, не gгидной группой окисленного иммуноявляется CO(CH2)4CONHNH2,глобулина или его фрагмента-.