СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЯ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии, к лабораторным способам выявления степени скрытого повреждения эритроцитов и изучения физико-химического состояния консервированных эритроцитов.

Наиболее известным способом изучения состояния мембраны эритроцитов является способ осмотической резистентности эритроцитов в средах с нарастающей гипотоничностью («Физиология человека» под ред. Р.Шмидта и Г.Тевса из-во год изд. том 2, стр.425). Измеряют степень гемолиза (фотометрическим методом) в зависимости от концентрации раствора хлористого натрия. У здорового человека 50% эритроцитов гемолизируются при концентрации хлористого натрия 4,3 г/л. При нарушениях структуры мембраны, обусловленных той или иной патологией организма, происходит отклонение от этого значения.

Недостатками способа являются его длительность и сложность, т.к. необходимо брать 10-20 проб и следить за их гемолизом, который может длиться до нескольких суток.

Другой известный способ определения степени повреждения эритроцитов в качестве повреждающего агента вместо хлористого натрия используют мочевину (А.С. №1220636, МПК G01N 33/49, 1986).

Указанный способ имеет те же самые недостатки, что и вышеуказанный.

Известен способ определения степени повреждения мембран эритроцитов, включающий центрифугирование исследуемой суспензии эритроцитов и определение концентрации гемоглобина в надосадочной жидкости (А.С. №1663549, МПК G01N 33Х49, 1991). В контрольном (нативном) образце суспензии эритроцитов определяют распределение клеток по объему. Осадок, полученный после центрифугирования, ресуспендируют в плазме и определяют в нем количество клеток, распределение которых идентично распределению клеток в контрольном образце. Степень повреждения в процентном выражении определяют как разность по отношению к образцу полностью лизированных клеток при - 196°C (повреждающий агент). Недостатками способа является его длительность и визуальный подсчет клеток.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ выявления повреждения мембран эритроцитов, заключающийся в том, что анализируемую пробу крови подвергают воздействию калиброванного пробойного импульсного электрического тока напряженностью 1800 В/см, длительностью импульса 6-10 мс и при увеличении скорости гемолиза по сравнению с нормой делают вывод о повреждении мембран эритроцитов.

Недостатком способа является его сравнительно невысокая точность.

Задачей изобретения является способ выявления повреждения мембран эритроцитов, позволяющий повысить точность выявления.

Поставленная задача решается способом, заключающимся в том, что анализируемую пробу крови подвергают воздействию электропорации вначале в прямом, а затем в перпендикулярном направлении электрического поля напряженностью 1100 В/см и длительностью импульса 6 мс и при увеличении скорости гемолиза по сравнению с нормой выявляют повреждение мембран эритроцитов.

Пробойному калиброванному электрическому воздействию подвергают как контрольную суспензию (нативную), так и исследуемую.

При проведении исследования в стандартных условиях, в частности при комнатной температуре (20-25°C), нет необходимости каждый раз определять электропорацию контрольной суспензии, можно сразу определять электропорацию исследуемой суспензии.

Оценку степени повреждения эритроцитов проводят на основе вычисления скорости уменьшения числа эритроцитов.

Электропорация клеток - процесс образования в мембранах сквозных пор под действием внешнего импульсного электрического поля Е. Она возникает, если наведенный трансмембранный потенциал Δφ_м выше некоторого критического значения потенциала пробоя мембраны Δφ_кр, то есть выполняется условие:

$$\Delta {\varphi }_{м}>\Delta {\varphi }_{кр}.\left(1\right)$$

Величина Δφ_кр определяется свойствами мембраны, и в частности средним количеством повреждений, неоднородностей и других дефектов, присутствующих в ней в нормальном состоянии. В результате заболеваний структура мембран нарушается, а следовательно, увеличивается количество дефектов и величина Δφ_кр уменьшается.

Наведенный трансмембранный потенциал Δφ_м определяется величиной напряженности внешнего электрического поля:

$$\Delta {\varphi }_{м}=\mathrm{1,5}rE\cos \Theta ,\left(2\right)$$

где r - радиус клетки; Θ - угол между радиус-вектором и вектором поля Е.

В кварцевую кювету помещены титановые электроды. Конструкция их установки позволяет располагать электроды либо вертикально (рис.2а), либо горизонтально (рис.2б). В кювету наливали 2,4 мл суспензии крови. Сопротивление суспензии R=100±5 Ом. Использовали импульс длительностью 6 мс с энергией 200 Дж, что соответствовало напряженности поля в растворе 1100 В/см.

Красные клетки крови - эритроциты имеют форму диска (дискоцит) в диаметре 7,5-8,2 мкм, по толщине 2 мкм. В зависимости от расположения клетки по отношению к вектору электрического поля на мембранах создается различный трансмембранный потенциал, в соответствии с формулой 2. Это показано на рис.1. Так клетка 1 расположена по вектору поля r=8 мкм и Δφ_v=660 мВ. Клетка 2 расположена поперек вектора поля, r=2 мкм, Δφ_м=165 мВ. Клетка 3 расположена под углом 45° к вектору поля, r=5,6 мкм, Δφ_м=462 мВ. Учитывая, что Δφ_кр=450-500 мВ, можно утверждать, что клетка 1 подвергается электропорации, на клетке 2 такой эффект невозможен, а клетка 3 может быть пробита с некоторой вероятностью (около 0,3-0,4).

При выполнении условия (1) в суспензии возникает осмотический гемолиз эритроцитов. Уменьшение количества эритроцитов, в результате их гемолиза n(t), приводит к уменьшению оптической плотности суспензии D(t). При малой концентрации раствора зависимость D(n) линейная:

D(t)=knl,

k - показатель ослабления, n - концентрация эритроцитов, l - толщина слоя суспензии.

Зависимость n(t) представляется экспоненциальной функцией вида:

n(t)=(n_0-n_ост)ехр(-βt)+n_ост,

где β - константа скорости уменьшения числа эритроцитов, n₀ - начальное число эритроцитов, n_ост - число негемолизированных эритроцитов. График D(t) называется кинетической кривой гемолиза. Зависимость D(t) регистрировали на спектрофотометре Apel PD-303 (Япония). Оценивали характерное время достижения D уровня 0,7 - Т_0,7, константу скорости β уменьшения числа эритроцитов для любого заданного промежутка времени и n_ост.

Очевидно, что если пробой мембран осуществлять двумя последовательными взаимно перпендикулярными импульсами (рис.2), то количество пробитых эритроцитов будет больше, чем при пробое одним или двумя однонаправленными импульсами (рис.3). Следовательно, при пробое двумя последовательными взаимно перпендикулярными импульсами станет меньше число негемолизированных клеток, станет меньше величина n_ост. Иными словами, о качестве и количественных оценках электропорации можно судить по большей статистической популяции гемолизированных эритроцитов. Это приведет к более точной оценке разницы констант скоростей β, характерных для заболевания и после лечения, а следовательно и более точной диагностике, и более точной оценке эффективности проведенного лечения.

Пример 1.

В кювету для электропорации налили 2,4 мл суспензии контрольной крови пациента (Кр. В.В., 37 лет).

В первом опыте, на вертикально расположенные электроды подавали последовательно с интервалом 0,5 секунды два одинаковых импульса электрического поля (1100 В/см, 6 мс). Кинетическая кривая представлена на рис.3. В этом опыте β=0,058, n_ост=0,53.

Во втором опыте в кювету налили 2,4 мл суспензии крови того же пациента. Подавали два импульса электрического поля (1100 В/см, 6 мс) с интервалом 0,5 секунд. Первый импульс был подан на вертикальные электроды (как и в первом опыте), а второй на горизонтальные электроды. Во втором опыте: β=0,077, n_ост=0,21.

Таким образом, в первом опыте результат электропорации оценивался по 47% клеток, а во втором по 79%. Поэтому полученная величина константы скорости осмотического гемолиза во втором опыте имеет более точное значение.

Пример 2

Пациент (Агр. Е.П., 44 лет), диагноз: макроцитоз на фоне хронических заболеваний. Для проведения диагностических процедур с помощью электропорации отбирали пробы крови до и после лечения. Суспензию крови по 2,4 мл помещали к кювету с титановыми электродами. Эффективность лечения оценивали двумя способами: электропорацией двумя последовательными прямыми импульсами на вертикальные электороды и электропорацией двумя последовательными ортогональными импульсами. Обе эти процедуры были проведены до лечения (исходая проба) и после лечения.

Результат представлен на рис.4.

1. Два прямых импульса, исходная проба: β=0,046, n_ост=0,52. После лечения: β=0,027, n_ост=0,63.

2. Ортогональные импульсы, исходная проба: β=0,231, n_ост=0,17. После лечения β=0,086, n_ост=0,20.

Таким образом, при одном и том же заболевании одного и того же пациента в первом случае (прямые импульсы) разница констант скоростей до и после лечения Δβ=0,019, а во втором (ортогональные импульсы) Δβ=0,145. В случае оценки эффективности лечения ортогональными импульсами разница констант скоростей Δβ была в 7,63 раза больше, чем для прямых импульсов. То есть в первом случае диагностика проводилась по 48% эритроцитов до лечения и по 37% - после. Во втором случае (ортогональные импульсы) по 83% эритроцитов до лечения и по 80% - после. А именно этот показатель позволяет оценить эффективность проводимого лечения.

Представленные данные позволяют сделать вывод о том, что достигнута задача изобретения - повышение точности выявления повреждений мембран эритроцитов, что в свою очередь ведет к повышению точности диагностики.

Настоящее изобретение относится к медицине и описывает способ выявления повреждений мембран эритроцитов, при котором пробу крови подвергают воздействию электропорации вначале в прямом, а затем в перпендикулярном направлении электрического поля напряженностью 1100 В/см и длительностью импульса 6 мс и при увеличении скорости гемолиза по сравнению с нормой выявляют повреждения мембран эритроцитов. Способ позволяет повысить точность определения. 4 ил., 2 пр.

Способ выявления повреждений мембран эритроцитов, заключающийся в том, что пробу крови подвергают воздействию электропорации в начале в прямом, а затем в перпендикулярном направлении электрического поля напряженностью 1100 В/см и длительностью импульса 6 мс и при увеличении скорости гемолиза по сравнению с нормой выявляют повреждения мембран эритроцитов.