Способ получения рекомбинантного активированного белка С человека Советский патент 1993 года по МПК C12N15/52 C12N15/84 

Изобретение относится к области генетической инженерии, в частности к получению рекомбинантной ДНК. кодирующей активный человеческий белок С.

Известные ранее способы получения белка С предполагают продуцирование неактивной формы белка С (профермент) с по- следующей обработкой высокими концентрациями тромбина или тромбина и тромбомодулина или другими дорогостоящими ферментами активации.

Способ продуцирования активированного белка С исключает этап активации за Счет того, что векторы экспрессии белка содержат ДНК кодирующую точку протео- литического расщепления в последовательности белка С, что приводит к прямой

экспрессии активированного белка С в ре- комбинантных клетках реципиентах.

Белок С синтезируется как неактивная молекула, пробелок С. Пробелок С претерпевает сложные процессы, приводящие к образованию ряда различных неактивных молекул. Активация белка С происходит в крови в результате реакции, в которой участвует комплекс тромбомодулин-тромбин. Активированный белок С вместе с кофактор- ным белком S является антикоагулянтом, играющим очень важную физиологическую роль.

Активированный белок С может предотвращать внутрисосудистый тромбоз и препятствовать распространению имеющихся сгустков.

00 СО

о о

00

ы

Тромбомодулин образует плотный сте- хиометрический комплекс с тромбином. Тромбомодулин, образующий комплекс с тромбином, полностью изменяет функциональные свойства тромбина. Тромбин обыч- но сгущает фибриноген, активирует кровяные пластинки и превращает кофакторы свертывания крови V и VIII и их активированные формы Va и Villa. Тромбин активирует белок С, но лишь очень медлен- но и неэффективно. В противополжность этому, тромбин, образующий комплекс с тромбомо дули ном, не сгущает фибриноген, не активирует кровяные пластинки и не превращает кофакторы свертывания V и VIII в их активированные контрпары Va и Villa, a действительно становится очень эффективным активатором белка С. Константа скорости активации белка С под действием тромбомодулина-тромбина в 1000 раз боль- ше константы скорости активации одного лишь тромбина.

Система коагуляции представляет собой цепную реакцию, включающую последовательную активацию проферментов е активные протеазы серина. Эта цепная реакция в конечном итоге приводит к образованию ферментного тромбина, который в результате ограниченного протеолмза превращает фибриноген кровяной плазмы в не- растворимый геяевый фибрин. Основными результатами данного коагуляционного каскада являются превращение фактора свертывающей системы крови X в фактор свертывающей системы крови Ха посредст- вом фактора свертывающей системы крови fXa и превращение протромбина в тромбин посредством фактора свертывающей системы крови Ха. Обе эти реакции происходят на поверхностях клетки, главным образом на поверхности кровяной пластинки, и для обеих реакций требуются кофакторы. Основные кофакторы, факторы V и Vlti, в данной системе циркулируют как относительно неактивные предшественники, но при обра- зовании нескольких первых молекул тромбина тромбин делает обратную петлю и активирует кофакторы за счет ограниченного протеолиза. Эти активированные кофакторы, Va и Villa, ускоряют как конверсию протромбина в тромбин, так и конверсию фактора X в фактор Ха примерно на пять порядков величины. Активированный белок С действует на гидролиз, приводя к прртео- литическому расщеплению, и необратимо разрушает кофакторы свертывающей системы крови Va и Villa, активированные формы неактивных факторов свертывающей системы крови V и VHI. В противоположность этому-, факторы свертывающей системы

крови V и VIII являются очень слабыми субстратами для активированного белка С.

Очень важным кофактором активированного белка С является белок S, другой зависящий от витамина К белок плазмы. Белок S значительно повышает регулируемый активированным белком С гидролиз факторов Va и Villa (в 25 раз).

Активированный белок С является новым прртивотромбическим средством с более широким терапевтическим индексом, чем существующие антикоагулянты, такие как гепарин и вводимые орально антикоагулянты типа оксикумарина. Ни профермент- ный белок С, ни активированный белок С не проявляет эффективность до тех пор, пока не образуется тромбин, поскольку тромбин должен превращать факторы свертывающей системы крови V и VIII соответственно в факторы Va и Villa; активированные формы этих двух кофакторов являются предпочтительным субстратом для активированного белка G. Тромбин также необходим для активации проферментного белка С, поскольку без комплекса тромбомодулин-тромбин профермент белка С не превращается в его активную контрпару.

Активированный белок С является, согласно требованию, антикоагулянтом, поскольку активированный белок С действует за счет инактивирующих кофакторов Va и Villa. Поскольку тромбин необходим для превращения факторов V и VI H в их активированные контрпары Va и Villa, то белок С действует лишь как антикоагулянт после образования тромбина. Обычные антикоагулянты, в противоположность активированному белку С, сохраняют постоянное антикоагулянтное состояние в течение всего срока, пока их дают пациенту, ввиду чего значительно повышается риск кровотечения по сравнению с белком С или активированным белком С. Таким образом, активированный белок С по требованию является антикоагулянтом широкого клинического полезного действия, который может использоваться как замена гепарина и оксикумарина.

При некоторых заболеваниях, таких как наследственная белковая недостаточность (дефицит белка С), профермент белка С имеет очень важное терапевтическое значение.

Хотя проферметичные формы белка С очень полезны для терапевтических целей, некоторые заболевания могут лечиться более эффективно путем приема пациентами активированной формы белка С, Так, например, при таких заболеваниях, как инфаркт миокарда или глубокий венный тромбоз (особенно в случаях после хирургической

операции нижних конечностей), пациенты имеют нормальные концентрации профермента белка С, недостаточные для активированного белка С, для предотвращения образования тромбов или удаления имеющихся тромбов.

Нуклеотидная последовательность зарождающегося человеческого белка представлена ниже:

Использование: генетическая инженерия, получение рекомбинантной ДИК, кодирующей активный белок С. Сущность изобретения: способ получения ре- комбинантного человеческого белка С предусматривает культивирование штаммов-реципиентов, трансформированных рекомбинантной плазмидной ДНК, причем данный вектор экспрессии состоит из последовательности ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность, где данная последовательность включает (начиная от концевой аминогруппы до концевой кзрбоксигруппы): сигнальный пептид и про- пептид у-карбоксилированного белка; легкую цепь человеческого белка С; дипептид лизин-аргинин, лизин-лизин или аргинин- аргинин; последовательность расщепления для ассоциируемой с клеткой протеазы, активированную тяжелую цепь человеческого белка С; промотор, расположенный таким образом, что приводит к экспрессии указанной последовательности, с последующим выделением и очисткой целевого продукта. 2 табл. ё

10

1 С

20

25

30

3S

40

.45

АТС TGG CAG СТС АСА AGC СТС CTGCTG TTC GTG GCC ACC TGGGGA АТТ

MET TRP GLN LEU TKR SER LEU LEULEU РНЕ VAL ALA THR TRPGLY ILE

51015

50 60 7080 90

ТСС GGC АСА CCA GCT CCT CTT GAC TCA GTGTTCТССAGC AGC GAG CGT

SER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VALPHESERSER SER GLU ARC

2025- 30

100 110 120130 140

GCC СЛС CAG GTG CTG CGG АТС CGC AAA CGT CCC AAC TCC TTC CTG GAG ALA HIS GLN VAL LEU ARC ILE ARC LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU 3540 45

150160 170 180190

GAG CTC CGT CAC AGC AGC CTG GAG CGG GAGTGC ATA GAGGAG АТС TGT

GLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLUCYS ILE GLUGLU ILE CYS 50 .55 60

200 210 220230 240

GAC TTC GAG GAG GCCAAG GAAATT TTC CAA AAT GTGGAT GAC АСА CTG

ASP PHE GLU GLU ALALYs GLUILE PHE GLN ASN VALASP ASP THR LEU

65-707580

250 260 270 280

GCC TTC TGG TCC AAGCAC CTC GAC GGT GAC CAG TGC TTG GTC TTG CCC

ALA PHE TRP SER LYSHIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO 859095

290 300 310 320 330

TTG GAG CAC CCG TGCGCC AGC CTG TGC TGC GGG CAC GGC ACG TGC АТС

LEU GLU HIS PRO CYSALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE 100105110

340 350 360 370 380

GAC GGC АТСGGC AGC TTC AGC TGC GACTGC CGC AGC GGC TGG GAG GGC

ASI GLY ILEGLY SER PHE SER CYS ASPCYS ARG SER GLY TRP GLU GLY 115 120125

390 400 410 420 430 CGC TTC TGC CAG CGC GAG GTG AGC TTC CTC AAT TGC TCG CTG GAC AAC ARC PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASN 130135 140

440 450 460 470 480 GGC GGC TGC ACG CAT TAC TGC СТА GAG GAG GTG GGC TGG CGG CGC TGT GLY.GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYS 145150155- 160

490 500 510 520

AGC TGT GCG CCT GGC TAC AAG CTG GGG GAC GACCTC CTG CAG TGT CAC

SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASPLEU LEU GLN CYS HIS 15 165 170175

530 540550 560 570

CCC GCA GTG AAG TTC CCT TGTGGGAGGCCC TGG AAG CGG ATG GAG AAG

70 PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYSGLYARGPRO TRP LYS ARG.MET GLU LYS

180 -.:. 185190

580 590 600 610620

AAG CGC ACT CAC CTG AAA CGA GAC АСА GAA GACCAA GAA GACCAA GTA

25 LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP TIER GLU ASPGLN GLU ASPGLN VAL 195 200 205

630 640 650 660 670 Q GAT CCG CGG CTC ATT GAT GGG AAG ATG ACC AGG CGG GGA GAC AGC CCC ASP PRO ARG LEU ILE ASP GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO 210215220

680 690 700 710 720 TGG CAG GTG GTC CTG CTG GAC TCA AAG AAG AAG CTG GCC TGC GGG GCA

TRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LJS LYS LYS LEU ALA CYS-GLY ALA 35 225 230 235 240

730 740 750 760

GTG CTC АТС CAC CCC TCC TGG GTG CTG АСА GCG GCC CAC TGCATG GAT

. VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYSMET ASP

: 245. 250255

770 780 790 800 810 45 GAG TCC AAG AAG CTC CTT GTC AGG CTT GGA GAG TAT GAC CTG CGG CGC GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG 260265270

820 830 840 850 860 TGG :GAG AAG TGG GAG CTG GAC CTG GAG АТС AAG GAG GTC TTC GTC CAC TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP-LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS 275280285

870 880 890900910

ССС АЛС TAG AGC AAG AGC АСС АСС GAC ДАТ GACАТС GCA CTGCTG САС

10 PRO ASN TYR SER LYS SER THR ТНК ASP ASN ASPILE ALA LEULEU HIS

290 295300

920 930 940 950 960

CTG GCC CAG CCC GCC ACC CTC TCG CAG ACC ATA GTGССС АТСTGC CTC

15 LEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VALPRO ILECYS LEU 305 310 315 . 320

970 980 990 1000

CCG GAC AGC GGC CTT GCA GAG CGC GAG CTC AAT CAG GCC GGC CAG GAG 20 PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU

325330335

1010 1020 1030 10AO 1050

ACC CTC GTG ACG GGC TGG GGC TAC .CAC AGC AGC CGAGAG AAG GAG GCC

25 TltR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARGGLU LYS GLU ALA 340 345350

106010701080 1090 1100

AAG AGA AAC CGCACC TTC GTCCTC AACTTC АТС AAG ATT CCC GTG GTC

30 LYS ARG ASN ARGTHR PHE VALLEU ASNPHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL

11101120 1130 1140 1150

CCG CAC AAT GAG TGCAGC GAG GTC ATG AGC AAC ATG GTG TCT GAG AAC

35 PRO HIS ASN GLU CYSSER GLU-VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN 370375380

1160 1170 1180 1190 1200

ATG CTG TGT GCG GGC АТС CTC, GGG GAC CGG CAG GAT GCC TGCGAG GGC

40 MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP ALA CYSGLU GLY 385 390 -395400

1210 1220 12301240

GAC ACT GGG GGG CCC ATG GTC GCC TCC TTC CAC GGC ACCTGG TTC CTG

45 ASP SER GLY GLY PRO НЕТ VAL ALA SER PHE HIS GLY THRTRP PHE LEU

405410415

1250 1260 1270 1280 1290

GTG GGC CTG GTG AGCTGG GGT GAG GGC TGT GGG CTC CTT AC AAC TAC

VAL GLY LEU VAL SERTRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR 420425430

1300 1310 1320 1330 ; 1340

GGC GTT TAC ACCАЛА GTC AGC CGC TAC CTC GAC TGG АТСCAT GGG CAC

GLY VAL TYR THRLYS VAL SER ARC TYR LEU ASP TRP ILEHIS GLY HIS 435 440 445

10

1350 1360 1370 1380

АТС AGA GAC AAG GAA GCC CCC CAG AAG AGC TGG GCA CCT TAG ILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO 2 450455460

Указанная выше последовательность ДИК получена из клонов с ДНК, полученных от мРНК (информационной РНК), которая кодирует человеческий белок С. При построении клонов сДНК концы кодирующей белок С сДНК застраиваются 5 поли С последовательностью, 3 по,лй С последовательностью, а также последовательностью, узнаваемой эндонуклеазой 5 и 3 Pst 1. Оба эти сДНК клона служат для построения молекулы ДНК, включающей как кодирующую последовательность зарождающегося человеческого белка С, так и части ДНК, кодирующие нетранслированную мРНК в 5 и 3 концах данной кодирующей зоны. Этот фрагмент ДНК клонируют в сайт Pst 1 плаз- миды pBR322, в результате чего получается плазмида рНС7. Таким образом, пламиза рНС7 включает указанную кодирующую яо- следовательность и дополнительные последовательности:

5 - С TGC АСС GGG GGG GGG GGG GGG GGG CTG ТСА TGG CGG CAG QAC GGC САА СТТ GCA GTA ТСТ CCA CGA ССС GCC ССТ АСА GOT GCC AGT GCC ТСС AGA - 3

. .

5 - CGA ССС ТСС CTG CAG GGC TQG GCT ТТТ GCA TGG САА TGG ATG GGA CAT ТАА AGG GAC ATG ТАА СА GCA CAC ССС ССС ССС ССС ССС ССС СС ССС CCTGCAG 3,

т.е. соответственно 3 и 5 концы кодирующей нити данного белка. Плазмиду рНС7 выделяют из штамма Г.. col) K12 RR1/pHC7, который хранится в Севернрй региональной научно-исследовательской лаборатории (NRRI), Пеория, Иллинойс, под номером NRRI В-15926. .....

Зарождающийся белок С также может быть представлен схематически как показано ниже:

4243 197 198 199200 211212 Ав1

рге-рго 1C KR АР АНС

пре-про-аминокислотные группы 1-42 зарождающегося белка С кодируют ный пептид ;w 4ppeeHe§KjfQ белка G, очень важный дл направленной

секреции И рЮфШтШШМ Ш §, LC-аминокислотные группы 43-197 зарождающегося белка С после посттрансляционной модификации создают легкую цепь

(UC).

KR - аминокислотные группы 198-199

зарождающегося белка С удаляются, по всей вероятности, в ходе дцу«|тапнргр п(в цесса, включающего первое расщепление (либр между остаточными группами 197 198, либо между остаточными группами 199-200) с последующим вчздействием кавбоксипептидаэы или аминопептидаэы с образованием белка С.

АР - аминокислотные группы 200-211 зарождающегося белка С составляют активационный пептид, который. удаляется из проферментных форм белка С с образованием активированного белка С.

АНС - аминокислотные группы 212-461 зарождающегося белка С, которые после

посттрансляционной модификации составляют активированную тяжелую цепь (АНС) активного белка С,

НС - тяжелая цеп двухцепной формы проферемента белка С. которая после посттрансляционной модификации образует аминокислотные группы 200-461, АР и АНС. Ограниченный протеолиз включает расщепление и удаление пре-пропептида, состоящего из аминокислотных групп 1-42, в

ходе внутриклеточного процесса и секреции зарождающегося полипептида из клетки и удаления аминокислотных групп 198 и 199с образованием двух цепей. Активация профермента в активную протеазу серина

включает протеолитическое расщепление пептидной связи ARG.-LE и (группы 211 и 212), Это последнее расщепление высвобождает додекапептид (группы 200-211), ко- . торый составляет концевую аминогруппу

большей (тяжелой) цепи двухцепной молекулы профермента,

Белок С в Значительной мере гликолизи- роваи, зтот созревшей фермент содержит около 23% углеводов. Белок С также содержит ряд необычных аминокислот; включая у-карбоксиглутаминовую кислоту и / -окси- аспарагиновую кислоту (эритро-L-/ -оксиас- парагат). у-Карбоксиглутаминовая кислота (два) получается в результате карбоксилированйя у-глутамина из группы гяутаминовой кислоты с помощью печеночной микросом- ной карбоксилазы, которой в качестве кофактора требуется итамин К.

Активация человеческого белка С также

может быть представлена схематически, как

nQKjisatfo няже.

ftBi-nporj.e-KRftp-AH§ ЯШ-трианг сяяционная модификация, т.е. у-карбокси- ирование специфических групп глутамино- врй кислоты.-гидррг KG«flHpQi9HMfРВУППМ

ggfifрагиновой Игликозилирование

Секреция,, удаление rfiynn T-42, KOtOpne огут

Зарождающийся белок С

включать более чем одно протеолитичес- кое расщепление

LC-KR-AP-AHC удаление групп 198-199, примерно 90% проферментного белка С, обнаруженного в человеческой кр является двухцепной фмой (5-5 дисульфид- ная связь)

Двухцепочечный профермент S-S

Активация тром- бином-тромбомоду- лином

АНС-АР

LC

Активированный белок С

S-S

AHI

Способ получения рекомбинатного человеческого белка С предусматривает культивирование штаммов - реципиентов трансформированием рекомбинантной плазмидой ДНК, причем данная ДНК состоит из 0) последовательности ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность, где данная последовательность включает, начиная от концевой аминогруппы до концевой карбоксигруппы:

(а) сигнальный пептид и про-пёптид у-карбоксилированного белка;

(о) легкую цепь человеческого белка С;

(c)дипептид лизин-аргинин, лизин-лизин или аргинин-аргинин;

(d)последовательность, расщепляющуюся ассоциированную с клеткой протеазой;

(e)активированную тяжелую цепь человеческого белка С;

(II) промотор, расположенный таким образом, что приводит к экспрессии указанной последовательности ДНК.

ДНК включает кодирующую последовательность дипептида L YS-ARG (KR), распо- ложенную в трансляционной рамке

считывания в непосредственном соседстве ниже кодирующей последовательности легкой цепи. Двухосновный дипептид, такой как L YS-ARG, располагается в зарождаю5 щемся белке между карбоксильной концевой группой данной легкой цепи и концевой аминогруппой последовательности расщепления ассоциированной клеткой протеазы. Двухосновные дипептиды, такие как L YS-L

0 YS или ARG-ARG, эквивалентны дипептиду L YS-ARG согласно данному изобретению.

Непосредственно ниже кодонов дипеп- тидов L YS-ARG находится последователь5 ность, кодирующая последовательность протеолитического расщепления. У концевой карбоксильной группы дипептида L YS- ARG человеческого белка С располагается 12 аминокислотный пептид, эктивационный

0 пептид, который удаляется путем протеолитического расщепления. В соединениях, которые используются в способе, последовательность активационного пептида заменена последовательностью, кодирую5 щей последовательность протеолитического расщепления для протеазы, которая ассоциирована с клеткой (табл.1).

Таким образом, зарождающийся белок

0 расщепляется у карбоксильной концевой группы легкой цепи (KR дипептид) и. кроме того, расщепляется у концевой аминогруппы активированной тяжелой цепи. Следовательно, группы, находящиеся между

5 дипептидом KR и точкой протеолитического расщепления (расположенной у концевой аминогруппы активированной тяжелой цепи) будут удаляться при обработке полипептида. Ввиду того, что эти две реакции

0 протеолитического расщепления будут удалять все группы, находящиеся между концевой карбоксильной группой легкой цепи и концевой аминогруппой тяжелой цепи, последовательность протеолитического рас5 щепления может содержать допонительные группы, не оказывая при этом нежелательного влияния на тип конечного продукта, активированного белка С, Таким образом, в данном способе могут использоваться по0 следовательности расщепления более длинные, чем те, которые приведены в табл.1. Хотя все приведенные выше последовательности расщепления содержат восемь групп, все эти восемь групп необязательны и, сле5 довательно, могут использоваться более короткие последовательности,

В трансляционной рамке считывания непосредственно ниже последовательности, кодирующей последовательность протеолитического расщепления, находится

кодирующая последовательность активированной тяжелой цепи человеческого белка С, При этом активированная тяжелая цепь человеческого белка состоит из групп с 212 по 461 зарождающегося человеческого белка С.

Ниже представлена последовательность аминокислотных групп зарождающегося полипептида, транслированного от транскрипта мРНК.

Данный полипептид начинается с пре- пропептида человеческого белка С, за кото

il2N-HЈT TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU P1IE VAL ALA THR TRP GLY ILE SER GLY THR PRO ALA PRO LEIT ASP SER VAL PHE SER.SER SER GLU ARC ALA HIS GLN VAL LEU AM ILE ARC LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLU

CLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS ASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU ALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GIN CYS LEU VAL LEU PRO

5

LEU GLU HIS. ASP fiLY ILE AKG PHE CYS GLY GLY CYS SER CYS ALA PRO ALA VAL LYS ARO SER ILE ASP GLY

PRO CYS GLY SER GLN ARG THR HIS PRO GLY LYS PHE HIS LEU LYS HF.T

ALA SER PHE SER GLU VAL TYR CYS TYR LYS PRO CYS LYS ARG TIER ARG

LEU LEU SEP. LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALA VAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS НЕТ ASP GLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ILE LYS GLU VAL PHE VAL HIS PRO ASN TYR SER LYS SER Till TMR ASt ASH ASP ILE ALA LEU LEU HIS LEU ALA GLN PRO

ALA THR LEU SER GUI THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU THR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG CLU LYS GLU ALA LYS ARG ASN ARG THR PHE VAL LEU ASN Plffi ILE .LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL НЕТ SER ASN НЕТ VAL SER CLU ASN НЕТ LEU CYS ALA

рым следует легкая цепь человеческого белка С, за которой следует дипептид (V - АРС, за которым идет последовательность расщепления рецептора инсулина, с последую- щей активированной тяжелой цепью человеческого белка С. Данный полипептид схематически изображен ниже: 20 pre-pro LC KR IRS AHC

Последовательность аминогрупп данного полипептида представлена ниже:

YS SP PHE GLU CLY ARG ARG CLY

CYS GLY CYS ARG LEU ASH GLU VAI. ASP ASP PRO TRP PRO SER ASP SER

HIS GLY SER GLY CYS SER GLY TRP LEU LEU LYS ARG ARG LYS PRO TRP

Tim CYS ILE TRP GLU GLY LEU ASP ASN AKG ARG CYS GLH CYS HIS MET GLU LYS ARG ARG LEU GLN VAL VAL

GLY ILK LF.U GLY ASP ARC GLN ASP AU CYS GLU GLY ASP SER GLY GLY PRO НЕТ VAL ALA SER PIE HIS GLY TOR TR PHE LEU VAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASK TYR GLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARC TYR LEU ASP TRP ILE JUS GLY HIS ILE ARC ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH

Активированный человеческий белок получают при использований кодирующей последовательности зарождающегося человеческого белка 0, из которого была удалена зона АР путем точечно-специфического му- тагенеза. Эта последовательность, представленная схематически, имеет следующую структуру:

пре-про LC KR АНС

Данную кодирующую последователь- ность встраивают в вектор экспрессии, пол- ученный в результате вектор pl APC трансформируют в эукариотические клетки реципиенты. Полученные трансформанты дают стандартные количества двухцепочеч- ного белка С. Плазмида pL APC служит также в качестве исходного материала для построения других векторов. Принцип и порядок построения плазмиды pL APC из исходной плазмиды рНС7 описывается в примере 1. Плазмида рНС7 взята из коллекции культур Северного регионального научно-исследовательского центра (NRRL), Пеория, IL 61604, Е . coll К12 RR1/pHC7 под номером регистрации NRRL В - 15926.

Осуществляют экспрессию активированного белка С путем создания кодирующей последовательности, в которой последовательность протерлитического расщепления встроена в кодирующую пси следовательность белка С между кодирующей последовательностью АР и кодирующей последовательностью АНС. Точка протеолитического расщепления встроена с последовательностью протеоли- тического расщепления, образованной от рецептора инсулина. Таким образом, эта Схематически представленная кодирующая последовательность имеет следующую структуру:

пре-про LC KR АР fRS АНС

Эта кодирующая последовательность встраивается в вектор pl APC, в результате чего получают плазмиды pl PC-1RS. Однако эукариотические клетки-реципиенты, со- держащие ллазмиду pL PCHRS, не обеспечивают получение активного белка С.

Способ прямого получения активированного белка С осуществляют после замены кодирующей последовательности АР кодирующей последовательностью IRS. Полученная в результате кодирующая последовательность, показанная схематически, имеет следующую структуру:

пре-про LC KR IRS АНС

Часть кодирующей последовательности белка С, включающей кодирующую актива- ционный пептид ДНК, выделяют из плами- дырНС7, вставляют в фаг М13 тр18 и затем видиоизменяют путем сайт-специфического мутагенеза. Затем эту кодирующую последовательность клонируют в эукариотиче- ский вектор, в результате чего получают плазмиду, обозначенную как pL APC-IRS, идентичную пламизде pl APC, за исключением вставки кодирующей последовательности IRS между кодирующими последовательностями KR и АНС. Плазмида pL APC-IRS отличается от плазмиды pL PCJRS лишь делецией кодирующей последовательности АР. Принцип и последовательность построения плазмиды pL APC-IRS подробно описываются в примере 3.

Плазмида pL APC-IRS включает ген-усилитель В К. предназначенный для стимулирования транскрипции основным поздним промотором аденовируса кодирующей последовательности белка С,

Полученным вектором экспрессии трансформируют эукориотические клетки (табл.2).

Способ иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Построение плазмиды pL APC.

Пламиза рНС7 содержит полную кодирующую последовательность зарождающегося человеческого белка С. 1 л питательного бульона L (10 г пептона, 10 г NaCI vt5 r дрожжевого экстракта), содержащего 15 МКР/МЛ тетрациклина, инокулируют с культурой E.coli K12 RR1/pHC7 {NRRL В - 15926) и инкубируют в инкубаторе с воздушным вибратором при 37°С до тех пор, пока не достигнуто значение оптической плотности (O.D.), при 590 нм равное примерно 1 ед., и а этот момент вводят в данную культуру 1 БОмгхромамфеникола. Инкубацию про- должают в течение примерно 16 ч; вывод хромамфеникола ингибировал синтез белка и таким образом ингибировал дальнейшее деление клеток, но он не предотвращал дальнейшую репликацию плазмиды.

Данную культуру центрифугируют в роторе при скорости 6000 об/мин в течение 5 мин при 4°С.

Образующийся поверхностный слой удаляют, и клеточные гранулы промывают в 40 мл буферного раствора ТЕ (10 мМол Трис- НС, рН-7,5, ЮмМол ЫаС1,и1 мМол ЕДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) и снова гранулируют. Поверхностный слой снова удаляют и клеточные гранулы замора- живэют в ванне с сухим льдом - этанолом, и затем они оттаивают. Оттаянные клеточные гранулы снова суспендируют в 10 мл раствора 25% сахарозы/50 мМол ЕДТА, В данный раствор вводят примерно 1 мл рас- твора 5 мг/мл яизозима; 3 мл 0,25 Мол ЕДТА, рН 8,0,. и 100 мкл 10 мг/мл рибонуклеазы А, и затем этот раствор инкубируют во льду в течение 15 мин. В обработанные лизоцимом клетки вводят в 3 мл лизирующего раствора {полученного путем смешивания 3 мл 10%-ного Тритона-Х 100, 75 мл 0,25 Мол ЕДТА, рН 8,0, 15 мл 1 Мол Трис-HCI, рН 8,0 и 7 мл воды), осуществляют перемешивание и образующийся рас- твор инкубируют во льду в течение еще 15 мин. Лмзированные клетки замораживают в ванне с сухим льдом - этанолом и затем их оттаивают.

Клеточные остатки удаляют из раствора путем центрифугирования со скоростью 25000 об/мин в течение 40 мин в роторе. В раствор вводят примерно30,44 гCsCI«около 1 мл раствора 5 мг/мл этилбромида и затем объем этого раствора доводят до 40 мл. Этот раствор декантируют в пробирке ультрацентрифуги. Пробирку герметически закрывают и затем осуществляют центрифу- гированиз в роторе при скорости вращения 42000 об/мин в течение около 16 ч. Получен- ную плазмиду, визуально наблюдаемую в ультрафиолетовом свете, выделяют, затем помещают в пробирку и в ротор и осуществляют центрифугирование со скоростью 55000 об/мин в течение 16ч, Регулирование до любого необходимого объема осуществляют с использованием TES, содержащего 0,761 г/мл CsO. Данную плазмиду снова выделяют, этидийбромид экстрагируют наг сыщенным солью иэопропанолом и окончательно разбавляют буферным раствором TES со степенью 1:3. Затем в данный раствор вводят два объема этанола и полученную смесь инкубируют в течение ночи при температуре - 20°С. Плазмиду ДНК гранулируют путем центрифугирования раствора в роторе ss34 в течение 15 мин при скорости вращения 10000 об/мин. Примерно 1 мг ДНК плазмиды рНС7, полученной в ходе этой процедуры, суспендируют в 1 мл буферного раствора ТЕ (10 мМол Трис-HCI, рН - 7,6, и 10 мМол ЕДТА) и выдерживают ее при температуре - 20°С.

Примерно 7 мкг (7 мкл) ДНК плазмиды рНС7 вводят в 25 мкл буферного раствора ТМ 10Х Core (буферный раствор Core TM, BRL состоит из 50 мМол Трис-HCI, рН 8,0, 500 мМол NaCi и 100 мМол MgCte), 198 мкМол НаО и 12 мкл ограничительного фермента и 7 мкл (80 ед) ограничительного фермента Sstl. Э.ту реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 4 ч, затем обработанную Sstl-Sa l плазмиду рНС7 ДНК экстрагируют сначала фенолом, а затем хлороформом, извлекают путем осаждения этанолом и центрифугирования, и, наконец, суспендируют в 15 мкл буферного раствора ТЕ/10 (10 мМол Трис-основание, рН 7,6, и 0,1 мМол ЕДТА).

Затем данную реакционную смесь подвергают электрофорезу на агарозном геле (0,6%) с низкой температурой гелеобразо- вания в течение 2-3 ч при 130 В и 65 мА в Трис-ацетатном буферном растворе. Этот гель окрашивают в разбавленном растворе этилбромида и фрагмент ДНК 0,7 кб Ssti- Satl, который визуально обнаруживают в ультрафиолетовом свете большой длины волны, отсекают от геля в виде небольшого сегмента. 0§ьем этого сегмента определяется его весом и плотностью, и в пробирку, содержащую этот сегмент, вводят четыре объема ТЕ, содержащего 0,25 Мол NaCI. Затем данный сегмент расплавляют путем инкубирования при 72°С, Получают примерно 0,5 мкг фрагмента 0,7 кЬ Sstl-SaH плазмиды рНС7 в объеме примерно 400 мкл. Дальнейшую очистку ДНК осуществляют путем пропускания раствора ДНК через колонку (BRL) в соответствии с рекоменда цйями изготовителя, очище н н ый фрагмент снова суспендируют в 15 мкл деи- онизированной воды.

Примерно 1 мкг ДНК фага М13 mpl8 (репликационной формы, RF) обрабатывают с ферментами Sstl и SaH. Реакцию прекращают путем экстрагирования реакционной смеси фенолом и затем хлороформом. Затем ДНК осаждают, извлекают путем центрифугирования и снова суспендируют

примерно в 15 мкл буферного раствора ТЕ. Два фрагмента, полученные в результате обработки, разделяют на 0,6% агарозном геле с низкой температурой гелеобразова- ния, больший фрагмент отсекают от данного геля и очищают.

Примерно 0,1 мкг(в7мкл HzO) фрагмент 0,7 Kb Sstl-Sall плазмиды рНС7 вводят в 5 мкл ДНК RF M13 тр18, обработанного Sstl- Sall, вместе с 2 мкл буферного раствора лигазы 10Х (0,5 Мол Трис-HCI, рН 7,8, 60 мМол MgCl2 и 0,2 Мол дитиотреитола (ДТТ), 2 мкл раствора 1 мг/мл BSA, 1 мкл 25 мМол АТР, 1 мкл ( 400 ед) лигазы Т4 ДНК (NEB) и 2 мкл воды). Эту реакционную смесь сшивки инкубируют при 25°С в течение ночи; сшитая ДНК представляет собой ДНК желаемого фага М13 тр.18-НЕ1 в виде двухниточной молекулы.

Примерно 300 мкл выращенной за ночь культуры E.coli K12 JM101 (New England Biolabs) используют для инокулирования 30 мл питательного бульона 2Х ТУ (питательный бульон ТУ состоит из 10 г/л триптона, 10 г/л NaCI и 5 г/л дрожжевого экстракта), и полученную культуру инкубируют при 37°С с одновременной аэрацией до тех пор, пока оптическая плотность (Q.D.)600 не достигала значения 0,5. Затем данную культуру замораживают в течение 10 мин в ванне со льдом-водой, извлекают путем центрифугирования и снова суспендируют в 15 мл холодной ЮмМол NaCI. Клетки снова собирают путем центрифугирования и затем снова суспендируют в 15 мл холодного 30 мМол .

Эти клетки помещают в лед на 20 мин и извлекают их путем центрифугирования. Клетки снова суспендируют в 1,5 мл холодного 30 мМол CaCl2, аликвоту этих клеток объемом 200 мкл удаляют, вводят в 9 мкл сшитой ДНК, полученной, как описано выше, и инкубируют на льду в течение примерно 30 мин. Смесь клетки - ДНК затем инкубируют при 42°С в течение 2 мин и затем вводят в 3 мл верхнего агара (питательный бульон ТУ с 0,5% агаром, расплавленным при 45°С), который содержит также 50 мкл 20 X-Gal (X-Gal представляет собой 5-бром-4-хлор-3-индолил-/ -О-галакто- пиранозид), 50 мкл 100 мМол IPTG (1PTG - это изопропил-/ -D-тио-галактопиранозид) и 100 мкл Е. coli K12 М101 в фазе логарифмического роста. Эту смесь клетки - верхний агар затем высевают на чашках с ТУ-агаром и чашки инкубируют при 37°С в течение ночи.

На следующее утро четыре прозрачные колонии по отдельности используют для

инокулирования 2 мл питательного бульона 2Х ТУ, и полученные культуры инкубируют при 37°С с одновременной аэрацией в течение 6 ч. Затем данные культуры центрифугируют и 500 мкл образующегося верхнего слоя (данные клеточные гранулы используют для получения ДНК фага для анализа ограничительного фермента) вводят в 500 мкл культуры (О.D.550 0,5) Е. col K12 J M101 и 50 мл питательного бульона 2Х ТУ. Эти ку.- .ьтуры инкубируют в течение ночи при 37°С. Фаговую RF ДНК выделяют из клеточных гранул с использованием варианта процедуры, с той разницей, что в данной среде культивации не использовалось никакого антибиотика, и этапы ультрацентрифугирования заменяют экстракциями Фенолом и хлороформом. Трансформанты, содержащие фаговую М13 тр18-НЕ1 ДНК, идентифицируют путем анализа ограничительного фермента или их фятрпй ДНК

Разведенные за ночь культуры центрифугируют и примерно 1 мл раствора, состоящего из 20% полиэтиленгликоля (PEG) 600 и 2,5 мМол NaCI, вводят в 5 мл поверхностного слоя, который затем инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. Смесь центрифугируют в течение 10 мин при скорости вращения 10000 об/мин, и образованные гранулы, содержащие однони- точную фаговую МТЗ тр18-НЕ1 ДНК, снова суспендируют в 500 мл буферного раствора TES (20 мМол Трис-HCI, рН 7.5, 0,1 мМол ЕДТА, и 10 мМол NaCI). Раствор ДНК экстрагируют сначала хлороформом, затем двукратно насыщенным ТЕ фенолом и затем снова хлороформом. Затем однониточную молекулу ДНК осаждают с использованием NaOAc (ацетата натрия) и этанола, центрифугируют и после промыки гранул 70% этанолом и сушки полученные гранулы растворяют в 80 мкл НаО. Этот фаговый препарат используют в следующем этапе, в сайт-специфическом мутагенезе, с целью удаления ДНК, кодирующей активационный пептид.

Фрагмент однониточной ДНК, используемый в операции мутагенеза для удаления кодирующей активационный пептид ДНК, синтезируют в автоматизированном устройстве синтеза ДНК (представлен ниже):

5-GCGCAGTCACCTGAAACGACTCATT GATGGGAAGATGA - 3

Примерно 30 пмоль (1 мкл) указанного выше фрагмента однониточной ДНК (мутагенный олинонуклеотид) и 1,5 мкл (7,5 пмоль) универсальной ДНК-затравки М13 обрабатывают, по отдельности 5 ед, лол- инуклеотид киназы Т4 в 10 мкл буферного

раствора киназы IX (100 мМол Трис-HCI, рН - 8,3, 100 мМол ДДТ, и 100 мМол MgCI2) с содержанием 1 мкл 1 мМол АТР в течение 30 мин при 37°С, с последующей инкубацией в течение 10 Мим при 65°С и замора- живанием. Обработанные киназой ДНК используют в сайт-специфическом мутагенезе.

В сайт-специфическом мутагенезе мутагенный олигонуклеотид и универсальную ДНК-затравку М13 ренатурируют до одно- ниточного ДНК фага. Реакцию ренатурации осуществляют путем ввода 300 пг (0,5 мкл) однониточного фага М13 в 1 пмоль (1,2 мкл) универсальной ДНК-эатрав- ки. 1 пмоль (0,3 мкл) мутагенного олигонук- леотида, 2 мкл ренатурирующего буферного раствора 10Х(100 мМол Трис-HCI, рН 7,5, 1 мМол ЕДТА и500 мМол NaCI) и 16 мкл Н20, инкубации смеси при 80°С в течение 2 мин. а затем при 50°С в течение 5 мин и, наконец, охлаждения смеси до комнатной температуры.

После ренатурации олигонуклеотидов фаговая ДНК становилась деухниточной за счет надстраивания затравки с ДНК полиме- раэой. Реакцию полимерации проводят путем ввода 3 мкл буферного раствора 10Х (500 мМол Трис-HCI, рН 8.1 мМол ЕДТА и 120 мМол MgCte), 3 мкл буферного раствора лигазы 10Х. t,5 мкл 0,2 мМол ДТТ, 3 мкл смеси d NTP (0,5 мМол в каждой d NTP), 1,2 мкл 25 мМол АТР, 0,5 мкл фермента Кленова (5 ед/мкл, 8MB), 1 мкл ТЧ ДНК лигазы (400 ед., NEB) и 19,8 мкл Н-гО в смесь ренатури- рОваннойДНК. Реакционную смесь полимеризации инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин, затем при 379С в течение 4 ч и затем в течениме ночи при4°С.

Реакцию прекращают в результате экстракции фенолом-хлороформом и осаждения ДНК этанолом и ацетатом натрия (NaOAc): ДНК извлекают путем центрифугирования и снова суспендируют в 40 мкл бу- ферного раствора SI (0,3 Мол NaCI, 0,03 Мол NaOAe, рН 4,5 и 0,3 мМол ZnCIa), после чего вводят в раствор ДНК.

Раствор ДНК распределяют в равных количествах по двум пробиркам, и в одну из пробирок вводят 100 ед(ВМВ) нуклеазы St. Реакционную смесь с SI инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин, и реакцию прекращают путем однократного экстрагирования реакционной смеси насы- щенным ТЕ фенолом - хлороформом (50:50), ДНК осаждают из данной реакционной смеси и из необработанного SI образца ацетатом натрия (NaOAc) с этанолом.

Гранулы ДНК повторно суспендируют в 60 мкл Н20 и используют для трансформации Е. co.ll K12 М101, Мутанты отбирают с использованием олигонуклеотида 5 - TGAAACGACTCATTGA - 3 (меченого). Некоторые колонии, которые оказывались позитивными за счет гибридизации, отбирают и по отдельности инокулируют в 2 мл культуры Е. cot K12 J M101 в фазе логарифмического роста. Эти культуры инкубируют при 37°С с одновременной аэрацией в течение примерно б ч и затем используют для получения однониточной ДНК, как описано выше для фага М13 тр18-НЕ1,

Последовательность аминокислотных групп однониточной ДНК определяют с использованием метода дидекиси-последова- тельности, Было идентифицировано несколько фагов с желаемой мутацией. Фаг; в котором аннулирована кодирующая последовательность активационного пептида, обозначен фагом М13 тр18-НЕ2. Мутация в фаге М13 тр18-НЕ2 вызвала уменьшение размера естественной кодирующей последовательности на 36 вр. Выделяют RF форму фагаМ13 тр18-НЁ2.

Sstt-Sal (0,7 ко) фрагмент RF формы фага М13 выделяют из данного фага. Однако 100 мкл раствора, содержащего 0,1 мкг желаемого фрагмента 0,7 кЬ в слабо желатинированной агарозе со степенью разведения 1:2, не пропускают через какую-либо колонку, а используют непосредственно в операции лигирования, в результате чего получают плазмиду pL APC,

Три фрагмента ДНК сшивают вместе с образованием плазмиды pL APC: это фрагмент 0.7 Kb Sstl-Sall фага М13 mp18-HE2 и два фрагмента ДНК от плазмиды pL PC.

Для получения фрагмента EcoRI-Sstl примерно 40 мкг плазмиды pL PC в 25 мкл Н20 вводят в 10 мкл 1 мг/мл BsA, 10 мкл буферного раствора ТМ Core 10Xx (BRL), 5 мкл фермента рестрикции Eco RI (50 ед, BRL), 5 мкл рестриктазы Sstl (25 ед, BRL) и 45 мкл HzO, и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 1,5 ч, Обработанную Rt плазмиду pt PC ДНК извлекают путем осаждения этанолом и центрифугирования. ДНК, обработанную Sstl-Eco RI, суспендируют в воде и затем помещают на агарозный гель с низкой температурой гелеобразования для разделения фрагментов ДНК путем электрофореза.

Для получения фрагмента Eco RI-SaM примерно 15 мкг плазмиды pL PC в 9 мкл НаО обрабатывают рестриктазой Apal. Примерно 10 мкл буферного раствора Apal 10X (60 мМол NaCI, 60 мМол Трис-HCI, рН - 7,4. 60 мМоя MgCl2 и 60 мМол ДТТ), 10 мкл 1

мг/мл BSA, 69 мкл НаО и 2 мкл рестриктазы Apal (50 ед, NEB) вводят в раствор ДНК плаэмиды pL PC, и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 1 ч. Затем 15 мкл 2 Мол NaCI, 69 мкл НаО, 8 мкл рестриктазы Sail (NEB) и 8 мкл рестриктазы Eco Rl (NEB) вводят в данный раствор плазмиды pL PC ДНК, обработанную ре- стриктазой Ара и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 1 ч. Фрагмент с Apal-SalO Eco Rl плазмиды pL PC ДНК экстрагируют сначала фенолом, а затем хлороформом, после чего извлекают путем осаждения этанолом и центрифугирования и в конечном итоге снова суспендиру- ют в 25 мкл НаО. Затем ДНК помещают на 0,6% агарозный гель с низкой температурой гелеобразования и фрагменты ДНК отделяют путем электрофореза.

Фрагменты 3,76 кЬ Eco RI-Sa t и 2,0 ко Eco Rl-Sstf отсекают от данных гелей и эти гелевые фрагменты расплавляют после ввода равных объемов 10 мМол Трис- HCI, рН 7,6. Таким образом, получают примерно 2 мкг фрагмента 3,76 кЬ Eco Rl-Sall плазмиды pL pC в 200 мкл 10 мМол Трис- HCI, рН 7,6, который содержит также расплавленную агарозу. Примерно 2 мкг фрагмента 2 ко Eco Rl-Sall плазмиды pL PC получают отдельно в 200 мкл 10 мМол Трис-НСК рН 7,6, который содержит агарозу.

Примерно 12,5 мкл раствора каждого из двух фрагментов (фрагмент 3,76 Kb EcoRI- Sall плазмиды pLPC и фрагмент 2,0 кЬ EcoRI-Sstl плазмиды pIPC) вводят в 20 мкл фрагмента, 0,7 ко Sstl-Sali фага М13 тр18- НЕ2, 10 мкл 1 мг/мл BSA, 10 мкл 10 мМол АТР, 10 мкл буферного раствора лигазы 10Х, 2 мкл ( 800 Ед., NEB) Т4 дНК лигазы и 23 мкл НаО, и полученную реакционную смесь лигирования инкубируют при 15°С в течение ночи. Сшитая ДНК составляет желаемую плазмиду pLAPC. Пламизда pLAPC отличается от плазмиды pLPC делецией, ко- дирующей активационный пептид ДНК.

Для проверки структуры плазмиды и получения больших количеств плазмиды pLAPC для трансформации эукариотиче- ской клетки и последующих построений плазмиду pL АР С используют для трансформации E.coit К12 RV308 из коллекции куль- typ NRRL, где она хранится под номером NRRLB-15624.

50 мл культуры E.coli K12 RV308 в пита- тельном бульоне L выращивают до достижения оптической плотности (О .Д.) при 590 нм, равной 0,6. Культуру охлаждают во льду в течение 10 мин и. клетки собирают путем центрифугирования. Клеточные гранулы повторно суспендируют в 25 мл холодного 10 мМол NaCI. Клетки снова гранулируют путем центрифугирования, и гранулы снова суспендируют в 25 мл холодного 30 мМол CaCIa и инкубируют во льду в течение 30 мин. Данные клетки снова собирают путем центрифугирования и снова суспендируют в 2,5 мл холодного 30 мМол CaCIa.

200 мкл этой клеточной суспензии смешивают с плазмидой PL APC, содержащей сшитую ДНК, и инкубируют во льду в течение 60 мин. Затем смесь инкубируют при 42°С в течение 2 мин, а затем в течение 10 мин при комнатной температуре. Примерно 10 мл питательного бульона ТУ 10Х вводят в смесь клетки-ДНК и затем клетки инкубируют в инкубаторе с воздушным вибратором в колбе объемом 125 мл при 37°С в течение 2 ч. Аликвоты этой клеточной смеси высевают на чашках с ТУ-агаром (питательный бульон ТУ с 15 г/л агара), содержащих 100 мкг/мл ампициллина, и чашки затем инкубируют при 37°С в течение ночи. Трансформанты E.coli K12 RV308/pL APC проверяют путем анализа их плазмиды ДНК на ограничительной фермент. Плазмиду ДНК получают из E.coli K12 RV308/pLAPC с той разницей, что в качестве агента отбора используют 50 мкг/мл ампициллина, а не тетрациклин.

Пример 2. Плазмиду pLPC используют как промежуточный вектор в построении плазмиды pL APC. Плазмида pL PC включает сегмент ДНК, который кодирует энхансер вируса В К и поздний промотор аденовируса 2, вызывая усиленную экспрессию человеческого белка С. Принцип и последовательность построения плазмиды pL APC приводит в результате к замене последовательности, кодирующей человеческий белок С на плазмиде pL PC, последовательностью, кодирующей другой белок С, из которой удалена ДНК, кодирующая активационный пептид.

ВК вирус получают из Коллекции культур американского типа, где он хранится под номером АТСС VR-837. Этот вирус поставляется в замороженно-высушенной форме и снова суспендируется в равновесной соли Хэнка с титром примерно 105 образующих колонии единиц (pfuj/мл. Хозяином, выбранным для приготовления ДНК вируса Выявляются клетки человеческой эмбриональной почки (РНЕК).

Для получения данного вируса используют примерно пять полистироловых колб {75 мм ), содержащих сливающиеся моно- слои примерно 10€ клеток РНЕК. Примерно 1 мл ВК вируса титром 10 pfu/мл вводят в каждую колбу, которую затем ингибируют при 37°С в течение 1 ч, и затем вводят свежую питательную среду для разведения, в которой содержится 10% эмбриональной бычьей сыворотки), и зараженные клетки инкубируют при 37°С в течение 10-14 дней или до тех пор, пока не выявлен полный цитопатогенный эффект вируса.

Данный вирус освобождают от клеток в ходе трех циклов замораживания-оттаивания и клеточные остатки удаляют путем центрифугирования при БОООХд. Данный вирус осаждают в 1 л поверхностной жидкости и собирают путем добавления 100 г РЕС-6000, инкубируют раствор в течение 24 ч при 4°С и центрифугируют в течение 20 мин при SQOQXg, Полученные гранулы растворяют в буферном растворе 0,1х SSC (IX SSC-0,15 Мол NaCI иО,015 Мол Цитрат Na, pH 7) при 1/100 исходного объема. Эту вирусную суспензию наносят в виде слоя на поверхность 15 мл раствора насыщенного КВг в про- бирке, которая центрифугировалась в течение 3 ч при 75000Хд, После центрифугирования в растворе КВг обнаруживают две зоны. Нижнюю зону, которая содержит полный вири- он, собирают и обессоливают в колонке на Sephadex G-50 с использованием ТЕ (10 мМол Трис-HCI, рН 7,8, и 1 мМол ЕДТА) в качестве элюирующего буферного раствора.

В раствор очищенных вириомов, полученных в данной колонке, вводят додецил- сульфат натрия (SDS) до концентрации 1 %, вводят проназу®(Сигма) протеаза до концентрации 100 мкг/мл и раствор инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Затем в раствор вводят хлорид цезия до плотности 1,56 г/мл и этидийбромид до конечной концентрации 100 мкг/мл. Данный раствор центрифугируют в роторе Son/all 865 или в аналогичном вертикальном роторе при 260000Хд в течение 24 ч. После центрифугирования зону вирусной ДНК выделяют и экстрагируют пятикратно изоамиловым спиртом, насыщенным 100 мМол Трис-НС, рН 7,8. Этот раствор ДНК вируса ВК затем диализируют на ТЕ буферном растворе до тех пор, пока степень поглощения при 260 нм/280 нм не составит 1,75-1,90, ДНК осаждают путем доведения концентрации NaCI до 0,15 Мол, ввода двух объёмов этанола, инкубирования данного раствора при -70°С в течение не менее чем 2 ч и центрифугируют этот раствор при 12000Хд в течение 10 мин. Полученные гранулы ДНК вируса ВК суспендируют в буферном растворе ТЕ концентрацией 1 мг/мл.

Клетки E.coli К12 HB101/pd BPV- MMTneo получают в лиофилизированной форме из Коллекции культур американского типа, где они хранятся под номером АТСС 37224, Эти лиофилизированные клетки высевают на чашки с L-агаром, содержащие 100 мкг/мл ампициллина, и инкубируют при 37°С, в результате получают изоляты одной колонии.

1 л питательного бульона L(10 г трипто- на, 10 г NaCI и 5 г дрожжевого экстракта на литр), содержащего 50 мкг/мл ампициллина, инокулируют колонией E.coli K12 HB101/pd BPV-MMneo и инкубируют в воздушном вибраторе при 37°С до тех пор, пока О.Д. 500 не достигнет 1 ед. поглощения, и в этот момент вводят 150 мг хлорамфенико- ла в данную культуру. Инкубирование продолжают в течение примерно 16 ч; ввод хлорамфеникола препятствует синтезу белка и, таким образом, дальнейшему делению клетки, но не препятствует дальнейшей репликации плазмиды,

Примерно 1 мг ДНК плазмиды pdBPV- MMTneo суспендируют в 1 мл буферного раствора ТЕ и выдерживают при -20°С. Когда желательно получение больших количеств очень чистой ДНК плазмиды, то осуществляют процедуру извлечения плазмиды, описанную в примере 1.

Примерно 5 мкг (5 мкл) ДНК плазмиды pdBPV-MMTneo и 5 мкг (5 мкл) ДНК вируса ВК, полученной, как описано выше, обрабатывают (каждую) при 37°С в течение 2 ч в растворе, содержащем 2 мкл буфера 10Х BamHI (1,5 Мол Nad, 60 мМол Трис-HCI, рН 7,9, 60 мМол MgCf2 и 1 мг/мл BSA), 1 мкл ( 10 ед) фермента BamHI и 7 мкл НаО. Реакцию прекращают в результате экстракции равным объемом фенола с последующими экстракциями хлороформом. Затем каждую ДНК, обработанную BamHI, осаждают, извлекают путем центрифугирования и снова суспендируют в 5 мкл Й20.

Примерно 1 мкл буферного раствора ли- газы 10Х вводят в смесь обработанной BamHI плазмиды pdBPV-MMTneo (1 мкл) и ДНК вируса ВК, обработанной BamHI (1 мкл). После ввода в эту смесь ДНК 1 мкл (5 ед) Т4 ДНК лигазы и 6 мкл Н2О полученную реакционную смесь инкубируют в течение ночи при 16°С.

Клетки Е.соП К12 НВ101 получают в лиофилизированной форме из Северной региона л ьной научно-исследовательской лаборатории, где они хранятся под номером NRRL В-15626. 50 мл культуры E.coli K12 НВ101 в питательном бульоне L выращивают до получения оптической плотности при 650 нм (О.Д.650) примерно 0,4 ед. поглощения. Данную культуру охлаждают во льду в течение ТО мин и клетки собирают путем центрифугирования. Клеточные гранулы снова суспендируют в 25 мл холодного 100 мМол MgCta и инкубируют вО льду в

течение 25 мин, Клетки еще раз гранулируют путем центрифугирования, и гранулы снова суспендируют в 2,5 мл холодного 100 мМол CaClz и инкубируют в течение 30 мин во льду, После инкубирования дан- ные клетки компетентны для поглощения трансформирующей ДНК,

200 мкл этой клеточной суспензии смешивают со сшитой ДНК, полученной, как указано выше, и инкубируют во льду в тече- ние 30 мин, В конце этого периода клетки помещают в водяную баню с температурой 42°С на 2 мин и затем их снова возвращают на лед, где они находятся еще в течение 10 мин, Эти клетки извлекают путем центрифу- гирования, снова суспендируют в 1 мл питательного бульона и инкубируют при 37°С в течение 1 ч. Трансформированные клетки высевают на чашках с L-агаром, содержащих 100 мкг/мл ампициллина. Трансфер- манты E.coli K21 HB101/pBKneol и E.coli К12/рВКпео2 идентифицируют по их стойкости к ампициллину и путем анализа их ДНК.

ДНК вирион аденовируса 2 (Ad2) пред- ставляет собой двухниточную линейную молекулу размером примерно 35,94 кЬ, Поздний промотор Ad2 выделяют на фрагменте 0,32 кЬ Accl-Pvull генома Ad2, этот фрагмент 0,32 ко соответствует последова- тельности между положениями нуклеотида 5755 и 6071 генома Ad2. Для выделения желаемого фрагмента 0,32 кЬ Accl-Pvult сначала Ad2 ДНК обрабатывают ферментом Ball и выделяют фрагмент 2,4 кЬ Ball, кото- рый включает всю последовательность фрагмента 0,32 Kb Accl-Pvull. Затем фрагмент 2,4 кЬ ВаН обрабатывают рестрикта- зами Асе и Pvull. в результате чего получают желаемый фрагмент,

Примерно 50 мкг Ad2 ДНК (получаемая из BRL) растворяют в 80 мкл НзО и 10 мкл буферного раствора 10Х Ball (100 мМол Трис-HCI, рН 7,6, 120 мМол MgCta, 100 мМрл ДТТ и 1 мг/мл BSA). Примерно 10 мкл (20 ед} реетриктазы Bali вводят в раствор Ad2 ДНК, и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 4ч.

Обработанную рестриктазой ВаН ДНК вводят в агарозный гель и подвергают элек- трофореэу. Визуализацию подвергнутой электрофорезу ДНК осуществляют путем окрашивания геля в разбавленном растворе (0,5 мкг/мл) этидийбрамида и обработки данного окрашенного геля длинноволновы- ми ультрафиолетовыми лучами. Способ выделения ДНК из агарозы заключается в следующем. В геле в передней части желаемого фрагмента проделывают небольшую щель, и небольшой кусочек мембраны NA-45

ДЕАЕ помещают в каждую щель, После дальнейшего электрофореза ДНК образует нековалентные связи с мембраной ДЕАЕ, После того как желаемый фрагмент связывался с мембраной ДЕАЕ, мембрану удаляют и промывают слабо солевым буферным раствором (100 мМол KCI, 0,1 мМол ЕДТА и 20 мМ(п Трис-HCI, рН-8).

Затем данную мембрану помещают в небольшую пробирку, и погружают в сильносолевой буферный раствор (1 Мол NaCI, 0,1 Мол ЕДТА и 20 мМол Трис-Hcl. рН - 8), и затем инкубируют при 65°С в течение 1 ч для удаления ДНК с бумаги ДЕАЕ. После инкубирования при 65°С буферный раствор собирают и мембрану промывают сильносолевым буферным раствором. Этот сильносолевой промывочный раствор сливают с сильносолевым буферным раствором инкубирования,

Объем сильносолевого раствора ДНК доводят до такого значения, чтобы концентрация NaCI составляла 0,25 Мол, и затем в этот раствор вводят три объема холодного абсолютного этанола. Полученный раствор перемешивают и выдерживают при температуре -70°С в течение 10-20 мин. Затем этот раствор центрифугируют в течение 15 мин со скоростью 15000 об/мин. После последующего осаждения с целью удаления остаточной соли гранулы ДНК промывают этанолом, высушивают, Снова суспендируют в 20 мкл буферного раствора ТЕ и в результате получают примерно 3 мкг желаемого фрагмента Ad2. Полученный очищенный фрагмент растворяют в 10 мкл буферного раствора ТЕ.

Примерно 5 мкл Н2О и 2 мкл буферного раствора 10Х Асе (60 мМол NaCI, 60 мМол Трис-HCI, рН 7,5, 60 мМол MgCl2, 60 мМол ДТТи 1 мг/мл 85А)вводят в раствор 2,4 кЬ Ball фрагмента Ad2. После ввода примерно 2 мкл ( 10 ед) фермента Accl в раствор ДНК реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. После гидролиза рестриктаэой Accl ДНК извлекают путем осаждения этанолом и повторно суспендируют в 16 мкл НгО и 2 мкл буферного раствора 10Х Pvu II (600 мМол NaCI, бОмМол Трис-HCI. рН 7,5, 60 мМол MgClz, 60 мМол ДТТи 1 мг/кг BSA). После ввода примерно 2 мкл (примерно 10 ед) фермента Pvull в раствор ДНК реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2ч.

Accl-Pvu III фрагмент 2,4 кЬ Ball промотора Ad2 вводят в 6% полиакриламидный гель и осуществляют электрофорез до тех пор, пока фрагмент 0,32 Kb Acct-Pvu III, содержащий поздний промотор Ad2, не отделяется от других продуктов гидролиза.

Данный гель окрашивают зтидийбромидом, исследуют в ультрафиолетовом свете, сегмент геля, содержащий фрагмент 0,32 кЬ Accl-PvuH, отсекают от данного геля, измельчают и пропитывают в течение ночи при комнатной температуре экстракционным буферным раствором (250 мкл) (50 мМол МЬйОАс, 10 мМол МдОАс, 1 мМол ЕДТА и 0.1% SDS). На следующее утро смесь центрифугируют и гранулы удаляют. ДНК в поверхностном слое осаждают этанолом, для гарантии полного осаждения желаемого фрагмента вводят примерно 2 мкг тРНК. Получают примерно 0,2 мкг фрагмента 0,32 Kb Accl-Pvulf, который суспендиру- ют в 7 мкл НаО.

Для превращения фрагмента Accl-Pvull в ограничительный фрагмент Accl-Bcll, связывающие линкерь Bell сшивают с фрагментом 0,32 ко Accl-Pvull. Поскольку линкеры Bell были с тупыми концами, то эти линкеры подсоединяют лишь к концу Pvull фрагмента. Линкеры Bell, которые имеют Следующую последовательность:

5 -CTGATCAG-3

S -GACTAGTC-B

обрабатывают киназой. 4 мкл линкера ( 2 мкг) растворяют в 20-15 мкл НаО, 5 мкл буферного раствора киназы 10Х (500 мМол Трис-HCI, рН;.« 7,6, и ТОО мМол MgCJa) инку- бируют в течение 2 мин при 90°С и затем охлаждают до комнатной температуры. 5 мкл y-32P-AJP ( 20 мкС1), 2,5 мкл 1 Мол ДТТ и 5 мкл полинуклеотйдкиназы ( 10 ед) вводят в данную смесь, которую инкубиру- ют при 37°С в течение 30 мин. Затем вводят 3,35 мкл 0.01 Мол АТР и 5 мкл киназы и реакционную смесь продолжают инкубировать при 37°С в течение еще 30 мин. Радиоактивная АТР позволяет определить, сшиты ли данные линкеры с конечной ДНК.

Примерно 0,25 мкг (в 0,5 мкл) обработанных киназой линкеров Bell вводят в раствор фяермента 0,32 кЬ Accl-PvuH, затем в раствор ДНК вводят 1 мкл ( 1000 ед) Т4 . ДНК лигазы и 1 мкл буферного раствора лигазы 10Х и полученную реакционную смесь инкубируют при 16°С в течение ночи. Линкеры Bell сшивают лишь с концом Pvull ограничительного фрагмента Accl-PvuH.

Дальнейшее определение последовательности аминокислотных групп ДНК позволило обнаружить, что линкеры Bell связаны с концом Pvull фрагмента Pvull, Эти линкеры Belt-удаляют путем обработки Bell и повторной сшивки, однако экстралинкеры Belt не удаляются, поскольку эти связывающие звенья не принимают участия в функционировании факторов.

Клетки E.colt K12 HB101/psv2cat получают в лиофилизированной форме из АТСС, где они хранятся под номером АТСС 37155, и ДНК плазмы psv2cat выделяют из данных клеток с той разницей, что используют ампициллин с концентрацией 50 мкг/мл вместо тетрациклина. Примерно 1 мг ДНК плаэмиды psv2cat получают и растворяют в 1 мл буферного раствора ТЕ. Примерно 3 мкг (3 мкл) ДНК плазмиды psv cat вводят в 2 мкл буферного раствора 10Х Accl и 16 мкл воды, затем 3 мкл (примерно 9 ед) фермента Accl вводят в раствор ДНК psv2cat и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Обработанную Accl плаэмиду psv2cat затем гидро- лизируют ферментом Stui введением 3 мкл буферного раствора 10Х Stut (1,0 Мол NaCI, 100 мМол Трис-HCI, рН 8,0, 100 мМол MgCl2, 60 мМол ДТТ и 1 мг/кг BSA), 5 мкл НаО и примерно. 2 мкл (примерно 10 ед) фермента stul. Полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Реакцию прекращают в результате экстракции реакционной смеси один раз фенолом, а затем деа раза хлороформом, Получают примерно 0,5 мкг желаемого фрагмента, который растворяют в 20 мкл буферного раствора ТЕ.

Примерно 4 мкл ДН К плазмиды psv2cat, обработанной с Acct-Stul, смешивают примерно с 7 мкл фрагмента 0,32 кЬ Accl-Pvull (с линкерами Bel) промотора Ad2 и после ввода 3 мкл буферного раствора лигазы 10Х, 15 мкл НаО и 2 мкл (примерно 1000 ед) лигазы Т4 ДНК реакционую смесь инкубируют при 16°С в течение ночи. Сшитая ДНК представляет собой желаемую плазмиду pLPcat, которая включает поздний промотор Ad2, находящийся в таком положении, что вызывает транскрипцию и, следовательно, экспрессию генахлорафениколацетилтрансфёрэзы.

Данную сшитую ДНК используют для трансформации клеток E.cotl K12 НВ101. Трансформированные клетки высевают на чашках с L-агаром, содержащих 50 мкг/мл ампициллина, для идентификации трансформированных E.coli K12 HB101/pLPcat, осуществляют анализ ДНК плазмиды на ограничительный фермент, ДНК плазмиды pLPcat выделяют из трансформантов для использования в последующих построениях.

Примерно 88 мкг ДНК плазмиды pBKncol и 50 мкл буферного раствора ТЕ вводят в 7,5 мкл буферного раствора 10Х АссК 30 мкл НаО и 15 мкл (примерно 75 ед) фермента Асе и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С е течение 2 ч, Гидролизованную Accl ДНК плазмиды рВ Kneel вводят агарозный гель и фрагмент

i,4 кЬ, содержащий ген усилитель ВК, отделяют от других продуктов. Фрагмент 1,4 кЬ Асе извлекают из геля и очищают. Примерно 5 мкг данного фрагмента повторно суспендируют в 5 мкл буферного раствора 10Х Pvull, 45 мкл Н20 и 5 мкл (примерно 25 ед} ограничительного фермента Pvull и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. ДНК, обработанную с Pvull, выделяют, очищают и приготавлива- ют для сшивки. Получают примерно 2 мкг фрагмента 1,28 кЬ Accl-Pvull и растворяют его в 5 мкл буферного раствора ТЕ,

Примерно 1 мкг ДНК плазмиды с LPCat растворяют в 5 мкл буферного раствора 10Х Асе и 40 мкл Н20. Примерно 5 мкл ( 25 ед) фермента Асе вводят в раствор ДНК плазмиды pLPcat и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С. Обработанную Асе ДНК плазмиды pLPcat осаждают этан о- лом и снова суспендируют в 5 мкл буферного раствора 10Х Stul, 40 мкл Й2.0 и 5 мкл (примерно 25 ед) фермента, Stul и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Обработанную Асе ДНК плазмиды pLPcat осаждают несколько раз этанолом с целью очистки фрагмента 4,81 кЬ Accl-Stul, включающего источники E.coll репликации и поздний промотор Ad2, от другого продукта гидролиза фраг- мента размером примерно 4,81 кЬ. Получают примерно 1 мкг желаемого фрагмента 4,81 ко и растворяют его в 20 мкл буферного раствора ТЕ.

5 мкл фрагмента 4,81 Kb Accl-Stul плазмиды pIPcat вводят в 5 мкл фрагмента 1,28 ко Accl-Pvull плазмиды pBKneol. После ввода 3 мкл буферного раствора лигазы 10Х, 15 мкл Н2О и 2 мкл (примерно 10 ед) лигазы Т4 ДНК в смесь ДНК полученную реакцион- ную смесь инкубируют при 1б°С в течение ночи. Эта сшитая ДНК составляет желаемую плазмиду pBLcat.

Эту сшитую ДНК используют для трансформаций клеток E.coll K12 НВ101. Транс- форманты Е.соИ К12 HB101/pBLcat идентифицируют путем анализа их ДНК. ДНК плазмиды pBLeat приготавливают для использования в последующих построениях.

Плазмида pL133 может быть построена с использованием исходных векторных плэзмид psv2gpt и рНС7 (получение плазмиды рНС7 описано выше в примере 1), с построением промежуточной векторной плазмиды psv2-HPC3, которую затем слива- ют с плаэмидой psv2- /S-глобином, и в результате получают плазмиду pL 133.

. 50 мкл ( 50 мкг) ДНК плазмиды рНС7 смешивают с 5 мкл ( 50 ед) фермента Bani, 10 мкл реакционного буферного раствора

10Х Ball (1,5 Мол Nad. 60 мМол Трис-НС1, рН 7,9, 60 мМол MgCl2 и 1 мг/кг BSA) и 35 мкл Н20 и инкубируют до тех пор, пока не происходит полный гидролиз. Затем ДНК плазмиды рНС7, обработанной с Ban, подвергают электрофорезу на 3,5%-ном поли- акриламидном геле (29:1, акриламид, бис-акриламид) до тех пор, пока фрагмент 1,25 кЬ Bartl не отделится от других продуктов гидролиза.

Область геля, включающую ограничительный фрагмент 1,25 кЬ Ban, отсекают от данного геля, помещают в испытательную пробирку и разбивают на небольшие фрагменты. 1 мл экстракционного буферного раствора (500 мМол NH40Ac, 10 мМол МдОАс, 1 мМол ЕДТА, 1% SDS и 10 мг/мл тРНК) вводят в данную пробирку, содержащую указанные фрагменты, и пробирку выдерживают в течение ночи при 37°С. Для гранулирования клеточных осколков осуществляют центрифугирование и поверхностный слой переносят в новую пробирку. Эти осколки промывают один раз 200 мкл экстракционного буферного раствора, поверхностный слой смешивают с первым поверхностным слоем от экстракции, осуществляемой в течение ночи. После пропускания поверхностного слоя через спрессованную стеклянную вату в этот поверхностный слой вводят два объема этанола и смесь перемешивают. Полученный раствор вводят в ван.ну сухой лед - этанол, где его выдерживают в течение 10 мин, и затем ДНК гранулируют путем центрифугирования.

Осуществляя данную процедуру, получают примерно 8 мкг фрагмента 1,25 кЬ Banl. Данный очищенный фрагмент суспендируют в 10 мкл буферного раствора ТЕ и выдерживают при-20°С. Фрагмент Banl модифицируют путем ввода линкера для построения плазмиды psv2-HPC8, фрагменты ДНК, Используемые для построения линкера, синтезируют.

500 пмоль каждой одиночной нити данного связывающего звена обрабатывают ки- назой в 20 мкл реакционного буферного раствора, содержащего 15 ед (0,5 мкл) пол- инуклеотидкиназы Т4, 2 мкл буферного раствора лигазы 10Х, 10 мкл 50 мкМол АТР, и 7,5 мкл Н20. Данную реакционную смесь киназы инкубируют при 37°С в течение 30 мин и реакцию прекращают в результате инкубирования при 100°С в течение 10 мин. Для гарантий полной обработки киназой реакционную смесь охлаждают во льду, в реакционную смесь вводят 2 мкл 0,2 Мол дитиотрёитола, 2.5 мкл 5 мМол АТР и 15 ед. лолинуклеотидкинэзы Т4, и эту реакционную смесь перемешивают и инкубируют еще в течение 30 мин при 37°С, Реакцию прекращают при дополнительном инкубировании в течение 10 мин при 100°С, и затем эту реакционную смесь охлаждают во льду.

Хотя обработка киназой осуществлялась раздельно, две одиночные нити связывающего звена ДНК смешивают друг с другом после реакции с киназой. Для рена- турации нитей реакционную смесь киназы инкубируют при 100°С в течение 10 мин на водяной бане, содержащей 150 мл воды. После такого инкубирования водяную баню отключают и охлаждают до комнатной температуры, что осуществляется в течение примерно 3 ч. Затем водяную баню, все еще содержащую пробирку с обработанной киназой ДНК, инкубируют в течение ночи при 4°С. 8 ходе данного процесса осуществляют ренатурацию одиночных нитей. Линкеры имеют следующую структуру: ,,

B -AGCTTTGATCAG-S1 IIIIIIII

3 -AACTAGTCCACG-5

Эти линкеры хранят при температуре -20°С до их использования.

Примерно 8 мкг фрагмента 1,25 кЬ Banl вводят в 50 мкл линкера (500 пмоль), 1 мкл лигазы Т4 ДНК ( 5 ед), 10 мкл буферного раствора лигазы 10Х и 29 мкл НаО, данную смесь перемешивают и образующуюся реакционную смесь сшивки инкубируют при 4°С в течение ночи. Реакцию лигирования прекращают в результате инкубирования при 65°С в течение 10 мин, ДНК гранулиру- ют путем ввода NaOAc до конечной концен- трации 0,3 Мол, 2 объемов этанола, охлаждения в бане со смесью лед-этанол и последующего центрифугирования данного раствора.

Гранулы ДНК растворяют в 10 мкл буферного реакционного раствора 10Х Ара (60 мМол NaCI,60 мМол Трис-HCf, рН - 7,4, 60 мМол MgCte и 60 мМол 2-меркаптоэтано- ла), 5 мкл (50 ед) фермента Apal и 85 мкл НаО и реакционную смесь выдерживают при 37°С в течение 2 ч. Затем реакцию прекращают и ДНК гранулируют, как описано выше. Гранулы ДНК растворяют в 10 мкл реакционного буферного раствора 10Х Hind III, 5 мкл (50 ед) фермента Hind 111 и 85 мкл НгО, и реакционную смесь выдерживают при 37°С в течение 2 ч. После обработки Hind III в реакционную смесь вводят 3,5%- ный полиакриламидный гель, желаемый фрагмент 1,23 ко Hind Ill-Apaf отделяют от геля и очищают, Получают примерно 5 мкл желаемого фрагмента, который суспендируют в 10 мкл буферного раствора ТЕ, и его хранят при температуре -20°С.

50 мкл (50 мкг) ДНК плазмиды рНС7 смешивают с 5 мкл (50 ед) фермента Pstl, 10 мкл реакционного буферного раствора 10Х Pstl (1,0 Мол NaCI; 100 мМол Трис-на. рН 7,5; 100 мМол MgCJa и 1 мг/мл BSA) и 35 мкл HzO, и реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. ДНК плазмиды рНС7, обработанную Pstl, подвергают электрофорезу на 3,5%-ном полиакриламидном геле, и желаемый фрагмент 0,88 кЬ очищают. Получают примерно 5 мкг желаемого, фрагмента, который суспендируют в 10 мкл буферного раствора ТЕ и хранят при температуре -20°С.

5 мкг фрагмента 0,88 кЬ Pstl вводят и смешивают с 50 мкл указанного ниже линкера, который был построен с помощью автоматизированного устройства синтеза ДНК:

5 -GTGATCAA-3 ПНИН

S -ACGTCACTAGTTCTAG-S Примерно 1 мкг лигазы Т4 ДНК ( 10 ед), 10 мкл буферного раствора лигазы 10Х и 29 мкл НгО вводят в смесь ДНК и полученную реакционную смесь сшивки инкубируют при 4°С в течение ночи.

Реакцию лигации прекращают в результате инкубирования при 65°С в течение 10 мин. После осаждения сшитой ДНК гранулы ДНК растворяют в 10 мкл реакционного буферного раствора 10Х Ара К 5 мкл ( 50 ед) фермента Apal и 85 мкл НаО, и реакционную смесь выдерживают при 37°С в течение 2 ч. Затем реакцию прекращают и ДНК снова гранулируют. Гранулы ДНК растворяют в 10 мкл реакционного буферного раствора 1.0Х Bglll (1 Мол Nad; ЮОмМол Трис-Hcl, ,4; 100 мМол MgCIa; 100 мМол 2-меркаптоэта- нола и 1 мг/мл BSA), 5 мкл (50 ед)фермента ВдИ и 85 мкл воды, и реакционную смесь выдерживают при 37°С в течение 2 ч. После обработки BglH в реакционную смесь вводят в 3,5%-ный полиакриламидный гель, и желаемый фрагмент 0,19 Kb Apal-BglH извлекают, Получают примерно мкг желаемого фрагмента, который суспендируют в 10 мкл буферного раствора ТЕ, и его хранят при температуре-20°С.

Примерно 10 мкг ДНК плазмиды psv2gpt (АТСС 37145) растворяют в 10 мкл реакционного буферного раствора 10Х Hind 111, 5 мкл ( 50 ед) фермента Hind lit и 85 мкл НаО, и реакционную смесь помещают в условиях температуры 37°С в течение 2 ч. Затем эту реакционную смесь доводят до концентрации NaOA-0,25 Мол после ввода

двух объемов этанола и инкубируют в бане со смесью сухой лед - этанол, ДНК гранулируют путем центрифугирования. Гранулы ДНК растворяют в 10 мл буферного раствора ЮХ Bglll, 5 мкл ( 50 ед) фермента Bglll и 85 мкл Н20, и реакционную смесь помещают в условиях температуры 37°С в течение 2 ч. После обработки с Bglll в реакционную смесь вводят в 1 %-ный агарозный гель и фрагменты отделяют путем электрофореза. Гель окрашивают этидийбромидом и визуально наблюдают в ультрафиолетовом свете; зону, содержащую желаемый фрагмент 5,1 кЬ Hind Ill-Bglli, отсекают от геля, помещают в пробирку для диализа и осуществляют электрофорез до тех пор, пока ДНК не извлекается из агарозы. Буферный раствор, содержащий ДНК, полученную s пробирках диализа, экстрагируют фенолом и и затем ДНК осаждают. Гранулы. ДНК снова суспендируют в 10 мкл буферного раствора ТЕ, и они состоят из 5 мкг желаемого фрагмента 5,1 кЬ Hind il-l-Bgltl плэзмиды psv2pgt.

Два мкл фрагмента 1,23 кЬ Hind III- Apal, 3 мкл фрагмента 0,19 кЬ Apal-Bgll и 2 мкл фрагмента 5,1 кЬ Hind Ill-Bgt перемешивают друг с другом и затем инкубируют с 10 мкл буферного раствора лигазы ЮХ, 1 мкл лигазы Т4 ДНК ( 500 ед) и 82 мкл ЬЪО при 16°С в течение ночи. Сшитая ДНК представляет собой желаемую плазмиду psv2- НРС8.

Клетки E.coli K12 RRi (NRRL B-15210) превращают в компетентные клетки для трансформации в соответствии с процедурой, описанной для E.coli K12 НВ101. Сшитую ДНК, полученную как описано выше, используют для трансформации данных клеток, а аликвоты трансформантов высевают на чашки с L-згаром, содержащим 100 м кг/мл ампициллина. Затем чашки инкубируют при 37°С. Трансформанты E.coli К12 RRI/psv2-HPC8 исследуют путем анализа их ДНК. Получают ДНК плазмиды psv2- НРС8 из трансформантов.

50 мкг плазмиды psv2-HPC8 растворяют в ТО. мкл реакционного буферного раствора ЮХ Hind III, 5 мкл (50 ед) фермента Hind III и 85 мкл НгО, и реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. После гидролиза Hind III осаждают ДНК и гранулы ДНК растворяют в 10 мкл реакционного буферного раствора 10Х Sal (1,5.Мол NaCI; 60 мМол ТриС-HCt. рН 7,9; 60 мМол MgCk; 60 мМол 2-меркаптоэтанолэ и 1 мг/мл BSA), 5 мкл ( 50 ед) фермента Sail и 85 мкл Н20. Полученную в результате реакционную смесь Satl инкубируют в течение 2 ч при

37°С. Плазмиду psv2-HPC8. обработанную Hind ill-Sail, вводят е 3,5%-ный полиакри- ламидный гель и осуществляют электрофорез до тех пор, пока желаемый фрагмент

Hind Ill-Sal ( 0,29 кЬ) не отделен от других продуктов реакции. Желаемый фрагмент отделяют от геля, получают примерно 2 мкг данного фрагмента, который суспендируют в 10 мкл буферного раствора ТЕ.

50 мкг плазмиды psv2-HPC8 растворяют s 10 мкл реакционного буферного раствора ЮХ Bglll, 5 мкл (50 ед) фермента Bglll и 85 мкл Н20, и реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. После гидролиза

5 осаждают ДНК и гранулы ДНК растворяют в 10 мл реакционного буферного раствора ЮХ Sal , 5 мкл ( 50 ед) фермента Sail и 85 мкл НгО. Образующуюся реакционную смесь инкубируют в течение .2 ч при 37°С.

0 Плазмиду psv2-HPC8, гидролизованную

Sali-Bglll, вводя R 5%-ньн полиакриламидчый гель и подвергают электрофорезу

до тех пор, пока желаемый фрагмент 1,15

кЬ Sall-Bglll не отделился от других продукЬ TQB реакции. Фрагмент 1,15 кЬ Sail-Bglll отделяют от геля, получают примерно 8 мкг фрагмента, который суспендируют в 10 мкл буферного раствора ТЕ.

0Примерно 10 мкг ДНК плэзмиды psv2/i-глобина (NRRL В-15928) растворяют в 10 мкл реакционного буферного раствора ЮХ Hind III, 5 мкл ( 50 ед) фермента Hind III и 85 мкл , и реакционную смесь помещ-а5 ют в условиях температуры 37°С в течение 2 ч, Затем реакционную смесь доводят до 0,25 Мол в NaOC, после ввода двух объемов этанола и инкубирования в бане со смесью сухой лед - этанол ДНК гранулируют путем

0 центрифугирования. Плазмиду psv2-/ -mo- бин, обработанную Hind Ml, растворяют в 10 мкл буферного раствора ЮХ Bgllli, 5 мкл (50 ед) фермента Bglll и 85 мкл Н20, и реакционную- смесь помещают а условиях

5 температуры 37°С на 2 ч. После гидролиза Bglll реакционную смесь вводят в 1 %-ный . агарозный гель и фрагменты отделяют путем электрофореза. Желаемый фрагмент 4,2 кЬ Hind Ill-Bglll отделяют от геля, пол0 учают примерно 5 мкг желаемого фрагмента, -который суспендируют в 10 мкл буферного раствора ТЕ.

2 мкл фрагмента 0,29 Kb Hind Ill-Sail 5 плазмиды psv2-HPC8, 2 мкл фрагмента 1,15 кЬ Sali-Bgiii плазмиды psv2-HPC8 и 2 мкл фрагмента 4.2 кЬ Hind Ill-Bglll плазмиды .psv2-/5-глобина перемешивают друг с другом и сшивают с лигазой ТА ДНК. Сшитая

ДНК представляет собой желаемую плазми- ду PL 133. Сшитую ДНК используют для трансформации E.coli K12 RRI, желаемые трансформанты E.col К12 RRI/pt 133 идентифицируют по их устойчивости к ампицил- лину, фенотипу и путем анализа их ДНК,

Примерно 20 мкг ДНК плазмиды pBL cat растворяют в 10 мкл буферного раствора 10Х Hind ill и 80 мкл Н20. Примерно 10 мкл ( 100 ед) фермента Hind Ш вводят в ДНК плазмиды pBL cat, полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2ч, ДНК плазмиды pBL cat, гидролизованную Hfnd III, вводят в агарозный гель и подвергают электрофорезу до тех пор, пока фраг- мент 0,87 кЬ Hind III, включающий ген энхансер ВК и поздний промотор Ad2, не отделится от других продуктов гидролиза, затем фрагмент 0,87 ко отделяют, очищают и обрабатывают для сшивки. Получают при мерно 2 мкг желаемого фрагмента, который растворяют в 5 мкл буферного раствора ТЕ.

Примерно 1,5 мкг ДНК плазмиды pL 133 растворяют в 2 мкл буферного раствора 10Х Hind HI и 16 мкл воды. В раствор ДНК вводят примерно 1 мкл ( 10 ед) фермента Hind HI и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 2 ч. Затем ДНК разбавляют до 100 мкл буферным раство- ром ТЕ, обрабатывают- 0,06 ед. щелочной фосфатазы кишечника теленка и полученную реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 30 мин, Раствор доводят до содержания в нем IXSET (5 мМол Трис-НС1, рН 7,8, 5 мМол ЁДТА и 150 мМол NaCI), 0,3 Мол NaOAc и 0,5% SDS и затем его инкубируют при 65°С в течение 45 мин. Обработанную Hind IH ДНК плазмиды pL 133 двукратно экстрагируют фенолом и одно- кратно хлороформом, осаждают этанолом и снова суспендируют в 10 мкл буферного раствора ТЕ.

Примерно 5 мкл фрагмента 0,87 кЪ Hind III плазмиды pBL cat вводят в 1,5 мкг (10 мкл) плазмиды pL 133, обработанной Hind HI, затем 2 мкл буферного раствора лигазы 10Х, 1 мкл ( 10 ед) дигазы ТН ДНК и 2 мкл НаО вводят в данный раствор ДНК и полученную реакционную смесь инкубиру- ют при 16°С в течение ночи. Сшитая ДНК представляет собой желаемую плазмиду pU PC.

Эту сшитую ДНК используют для транс- формации E.coli K12 НВ101. Трансформированные клетки высевают на чашки с L-эгаром, содержащим ампициллин, и ДНК, стойких к ампициллину трансформантов, исследуют путем анализа на фермент с

целью обнаружения E.coll K12 HB101/pL PC. Фрагмент 0,87 ко Hind IH. который кодирует ген-усилитель ВК и поздний промотор Ad2, встраивают в плазмиду pL 133, обработанную Hind til в одной или двух ориентации, лишь одна из которых дает плазмиду pL PC.

Пример 3. Плазмиду pL APC-IRS строят с помощью сайт-специфического мутагенеза.

При построении плазмиды pL APC-IRS фагМ13 mp18-HE1 подвергают сайт-специфическому мутагенезу с использованием следующего олигонуклеотида:

S -CGCAGTCACCTGAAACGACCC CG CCCCAGCCCCAAGCGG CG С СТС ATTG А TTGATGGGAAGATG - З1

Этот фаг, полученный в результате сайт- специфического мутагенеза, обозначает М13тр18-НЕЗ,

Плазмиду pL APC строят с использованием двух фрагментов от плазмиды pt PC. При построении плазмиды pL APC-IRS используют эти же два фрагмента вместо фрагмента, полученного от плазмиды pL APC. Поскольку плазмиды pL PC и pL APC- IRS очень близки по размеру, то довольно трудно отличить источники (плазмиды pL PC) от плазмиды pL APC-IRS. Однако ввиду того, что плазмида pL APC меньше, чем плазмйда pL APC-IRS, то, получая два фрагмента от плазмиды pL APC, можно легко отличить источнику (плазмиды pL APC) от желаемой плазмиды pL APC-IRS. Таким образом, для построения гглазмиды pL APC- IRS фрагмент -0,7 кЬ Sst-SaH фага М13 тр18-НЕЗ лигируют с фрагментом 3,76 кЬ EcoRI-SaH плазмиды pL APC и фрагментом 2,0 кЬ EcoRI-Sstl плазмиды pL APC, Сшитая ДНК представляет желаемую плазмиду pL APC-IRS, которую трансформируют в E.coli К12 RV308. Образующиеся в результате трансформанты E.coll K12 RV308/pL APC- IRS используют для получения в больших количествах ДНК плазмиды pL APC-IRS.

Пример 4, Клеточную линию 293 эмбриональной человеческой почки получают из Коллекции культур американского типа, где она хранится под регистрационным номером АТСС CRL 1573. Трансформированную аденовирусом клеточную линию золотистого хомячка AV12 также получают из Коллекции культур американского типа, где она хранится под регистрационным номером АТС CRL 9595.

Клетки 293 получают из коллекции культур АТСС, где они хранятся под регистрационным номером CRL 1573, в колбе 25 мм2, содержащей сливающийся монослой примерно 5,5 х 10 клеток в минимальной основной среде Eagle (Glbco) с содержанием 10% инактивированной нагреванием лошадиной сыворотки. Колбу инкубируют при 37°С, среду заменяют дважды в неделю. Среда состоит из ДМЕМ (Glbco), снабженной 10% эмбриональной телячьей сыворотки. 50 мкг/мл гентамицина и Юмкг/мл фитона- дион витамина Ki водного MEPHYTON . Клетки субкультивируют путем удаления среды, промывки равновесным солевым раствором НапК (Glbco), ввода 0,25% трипсина (содержащего 0,2 г/л ЕДТА) в течение 1-2 мин, промывки свежей средой, отсасывания и ввода в новые колбы при степени субкультивации 1:5 или 1:10.

За один день до трансформации осуществляют высевание клеток при норме 0,7 х ТО клеток на 100 мм чашки. Стерильную осажденную этанолом ДНК плазмиды, растворенную в буферном растворе ТЕ, ис- пользуют для приготовления раствора 2Х ДНК - CaClz. содержащего 25 мкг/мл ДНК трансформирующей плазмиды (для трансформаций плазмиды pL APC-IRS используют плазмиды: плазмида pL APC-IRS и плазмида, которая содержит отбираемый маркерный ген, как обсуждается ниже) и 250 мМол CaCfe. Приготавливают раствор 2Х HBSS, содержащий 280 мМол NaCI, 50 мМол Hepes и 1,5 мМол фосфата натрия, с регулированием величины рН до 7,05-7,15, Раствор 2Х ДНК-СаС12 вводят по каплям в равный объем стерильного раствора 2Н HBSS. Одномил литровую пластмассовую пипетку с ватной пробкой вставляют в пере- мешивающую пробирку, которая содержит 2Х HBSS, и вводят в нее пузырьки путем продувки с одновременным вводом ДНК. Происходит осаждение фосфата кальция - ДНК при комнатной температуре в течение 30-45 мин без перемешивания.

Затем данный осадок перемешивают путем осторожного забора пластмассовой пипеткой и 1 мл (на чашку) осадка вводят непосредственно в 10 мл питательной ере- ды разведения, который покрывает клетки реципиента. После инкубирования при 37°С а течение 4 ч данную питательную среду заменяют свежей средой и клетки инкубируют дополнительно в течение 72 ч. после чего подвергают воздействию выбранного давления. Для плазмид, которые не включают отбираемый маркерный ген. функционирующей в эукариотических клетках, таких как плазмида pL APC-IRS, в процедуре транс- формации используют смесь плазмид: вектор экспрессии, в котором отсутствует отбираемый маркерный ген, и вектор экспрессии, который включает отбираемый маркерный ген, функционирующей в эукариотических клетках. Ряд векторов доступен для использования в таких системах котрансформации, и они включают плаэмиды psv2-dhfr (ATCC 37146), psv2-neo (ATCC 37149). psv2-gpt (ATCC 37145) и psv2-hyg (RRL В-18039). Плазмида psv2hyg обеспечивает стойкость к гидромицину эукариотиче- ским клеткам-хозяевам. Такой способ контрансформации позволяет осуществлять отбор клеток, которые содержат плазмиду с отбираемым маркерным геном. Эти клетки дополнительно исследуют для идентификации клеток, которые включают обе трансформирующие плаэмиды.

Для клеток, трансфектированных плазмид ами, содержащими придающий стойкость к гидромицину ген, гидромицин В вводят в среду разведения до конечной концентрации примерно 200 мкг/мл. Эти клетки затем инкубируют при 37°С в течение 2-4 недель с заменами среды с интервалами на 3-4 день. Полученные стойкие к гидромицину колонии переносят в отдельные колбы с культурами для определения их характеристик. Плазмида psv2-neo сообщает стойкость к неомициму (G418 также используется вместо неомицина), и отбор стойких к неомицину колоний осуществляют в основном согласно процедуре, используемой для стойких к гидромицину клеток, с той разницей, что вводят G 418 до конечной концентрации 400 мкг/мл.

Использование дигидрофолятредуктаз- Horo(dhfr) гена или придающего стойкость к метотрексату производного гена dhfr(dhfr- mtx)e качестве отбираемого маркерного гена для ввода гена или плаэмиды в клеточную линию с дефицитом dhfr и последующее использование метотрексдта для усиления экспрессии данной плазмиды известно. Клетки 293 являются позитивными dhfr клетками, так что трансформанты 293, которые содержат плаэмиды, включающие ген dhfr, не отбираются исключительно на основе dhfr-позитивного фенотипа, который способен расти в питательной среде, где отсутствуют гипоксантин и тимин. Клеточные линии, в которых действительно отсутствует функциональный ген dhfr и которые трансформируются плазмидами, содержащими dhfr, отбирают на основе dhfr фенотипа.

В результате трансформации клеточных линий 293 и AV12 смесью плазмиды pLAPC- 1Р5вектора. придающего стойкость к гидромицину, и последующего отбора на стойкие к гидромицину клетки получают ряд трансформации. (Другие трансформации осуществля ют с использованием плазмиды psv2- пео в качестве контрансформирующего вектора и путем отбора на стойкие к G 418 клетки). Эти трансформанты анализируют, как описано в примере 5, для определения, какие стойкие к гидромицину клетки содержат плазмйду pL APC-IRS.

При м е.р 5. Стойкие к гидромицину трансформанты, полученные по примеру 4, выращивают в чашках на 100 мм2 культуры ткани плотностью несколько сотен клеточных клонов на чашку с культурой ткани. Данную среду декантируют и клетки двукратно промывают 5мл аликвотами равновесного солевого раствора Hank (Gtbco). Раствор стерильного 0,45% агара (агароза типа Сигма 4) приготавливают путем смешивания 1 мл 1,8% агара (47%) с модифицированным Dulbecco солевым раствором (ДМЕ) Eagle (Glbco)(37°C) и 2 мл этого 45% раствора агара наносят слоями на клетки.

Нитроцеллюлозные фильтры кипятят и затем обрабатывают в автоклаве в течение 2 ч для удаления смачивающего агента, ко- торый токсичен для клеток. Затем фильтры помещают сверху агарового слоя, и после того как воздушные пузырьки удалились, чашки инкубируют при 37°С в течение 1 -3 ч. Данные фильтры с предварительно сделан- ными метками для указания исходной ориентации фильтра на чашке с тем, чтобы облегчить последующую идентификацию колоний, затем удаляют и помещают в PBS (50 мМол Трис-HCI, рН « 7,2, и 150 мМоп NaCl).

Для сохранения клеток на чашке жизнеспособными в ходе анализа на данных фильтрах, клетки покрывают слоем, состоящим из 8 мл смеси, содержащей 2 мл 1,8% агара (47°С), 2 мл солей ДМЕ (37°С} и 4 мя солей ДME с 20% эмбриональной бычьей сыворотки (37°С). Затем клетки помещают в инкубатор при 37°С.

Все промывки и реакции осуществляют на фильтрах, которые помещают на качаю- щейся платформе. Эти фильтры сначала блокируют путем инкубирования при комнатной температуре в 5% молоке в PBS. Затем эти фильтры четырехкратно промывают (5 мин) в PBS. В фильтр вводят 10 мкг/мл биотинилированного Ноликлональногр антитела козьего античеловеческого белка С в 2,5% альбумине бычьей сыворотки (доста- точн ые количества для покрытия фильтра) и затем осуществляют инкубирование при 37°С в течение t ч

Проводят очистку белка С для последующего использования и получения антитела протиабелкаС.

Фильтры промывают четыре раза PBS при 4°С. Затем.приготавливают авидин и биотицилированную пироксидазу редьки полевой. Фильтры инкубируют с конъюги- рованкым с НРР авидином Д в течение 1 ч при 4°С (более длительное время инкубирования, например в течение ночи, может быть использовано при секретировании небольших количеств белка), затем фильтры четырехкратно промывают PBS при 4°С.

Для проявления цвета индикатора на фильтрах примерно 30 мг проявляющего, цвет реагента НРР (4-хлор-1-нафтол, Sigma), растворенного в смеси лед-холодный 100% метанол, вводят в 50 мл PBS и 30 мкл 30% Н2Оа: Эту смесь вводят в нитроцеллюлоз- ные фильтры, которые инкубировались при комнатной температуре до тех пор, пока не проявлялся цвет, Колонии, секретирующие большинство человеческого белка С, обнаруживают на фильтре не только по раннему проявлению цвета, но и по более темным пятнам на фильтре.

После проявления фильтров их снова выравнивают с исходными посевами на чашках для того, чтобы определить, какие колонии ассоциировались и с какими точками на фильтре. Затем колонии, секретирующие большинство человеческого белка С, отбирают и используют для продуцирования активированного человеческого белка С.

П р и м е р 6. Супернатант отделяют от клеток, экспрессирующих рекомбинантный продукт, и очищают на колонке фармация Моно-Q. Около 1 мл смолы уравновешивают 20 мМ Трис-HCI (рН 7,4), О, Т5 М NaCl. Куль- туральный супернатант доводят до рН 7,4 путем прибавления Трис-HCI (рН 8,0) и доводят до 0,15 М NaC1 путем прибавления 1 М NaOt. Супернатант нагружают на смолу в колонке и промывают тремя объемами колонки Трис-НС1(рН 7,4), 0,15 М NaCt, Реком- бикантный продукт элюируют из колонки с использованием буфера для элюирования, содержащего 0,4 М NaCf в 20 мМ Трие-НС (рН7,4),

Удельную активность лродукта определяют следующим образом: концентрированный продукт из колоночного элюента вначале активируют комплексом иммобилизованный тромбин-тромбомо- дулин, Амидолитичеекую активность продукта измеряют гидролизом трипептидного субстрата S-2238 {полученного из Хелена Лабораториз). Анти- коагулянтную активность продукта определяют пролонгированием времени активированного частичного тромбопла4b18300814б

стина с использованием реагентов из Хеле-шим фрагментом Sst1-Sa 1 фага М13 гпр 18 на.с получением фага М13 глр 18 НЕ1, прове- Формула изобретениядения сайт-специфического мутагене- Способ получения рекомбинантного ак-за в фаге М13 mp 18-HE-1 с тивировэнного белка С человека, заключаю-5 использованием олигонуклеотида 5- щийся в том, что осуществляютGCGCAGTCACCTGAAACGACTCATTGATG трансформацию штамма культивируемыхGGAAGATGA-3 с получением фага М13 тр клеток АТСС CR4 9599 или АТСС CR4 157318-НЕ2, линкования фрагмента Sst1-Sal1 рекомбинантной плазмидной ДНК, кодиру-размером 0,7 кЬ фага М13 тр i8-Ht2 с ющей активированный белок С человекаю фрагментом EcoR1-Sal1 размером 3,76 кЬ и содержащей сигнальный пептид и пропеп-плазмиды pLPC и фрагментом EcoR1-Sai1 тид у-карбоксилированного секретирован-размером 2,0 кЬ плазмиды pLPC с полученого белка, .пегую цепь человеческого белканием плазмиды pL APC, затем проведе- С, дипептид лизин-аргинин, или лизнн-ли-ния сайт-специфического мутагенеза зин, или аргинин-аргинин, последователь-15 в фаге М13 rrip 18/HE1 с использова- ность расщепления для ассоциируемой сн и ем о л к гонуклеотида 5 - клеткой протеазы. которая представляет со-CGCAGTCACCTG AAACG ACCCCGCCC бой PRO-ARG-PRO-SER-ARG--ARG и зкт ;-CACC.CGCAAGCGGCGCCTCTTGATGGGAA вированную тяжелую цепь человеческогоGATG- 3 с образованием фага М13 тр 18- белка С, культивирование трансФормиро-20 МЕЗ и лигнрованием фрагмента Sst1-Sal1 ванного штамма 293/pL ABC-IRS илиразмером 0.7 к1: фг.гз М13 тр 18 НЕЗ с AV12/pLAC-IRS, выделением очистку белкафрагментом EcoR1--Sal1 размером 3,76 кЬ С, при этом плазмидмую ДНК конструируютплазмиды pL APC и фрагментом EcoR1-Sst1 в результате лигирования фрагмента Sstl-размером 2,0 кЬ плазмпды pLAPC иобразо- Sai1 размером 0,7 кЬ плазмиды рНС с боль-25 ванием плазмиды pLAPC-IRS.

ТЕР GLbi LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA T1LR TRP GLY -ILL 2S .

SER Gi.Y THR PRO ALA PRO LEU- ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARC

ALA HIS GLN VAL LEU AKG ILE ARC LYS ARC ALA ASK SER PHE LEU GLU

36GLU LEU AKG HIS SER SER LEU GLU ARC GLU CYS ILE GLU GLU ILE CYS

AST PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PIS GLN ASN VAL ASP ASP THR LEU

ALA PIIK TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PRO 1.Г11 GLU illS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILE

ASP GLY ILE GLY SER РПЕ SER -CYS ASP CYS ARC SER GLY TKP GLU GLY

5 ARG PHE .CYS GUI AKG GLU VAL SER PUE LEU ASN CYS SER LEU ASP ASK

GLY GLY CYS Tlik HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG AKG CYS

SER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HIS 10- .

PRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG FRO TRP LYS ARG MET GLU LYS

LYS ARG SER HIS LEU LYS ARG PRO ARG PRO SER AKG LYS ARG ARG LEU

15ILE ASP GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PRO TRP GLN VAL VAL

LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALAVAL LEU ILE HIS

PRO SKI-; TRP VAL LEU TI1K ALA ALA HIS CYS NET ASP GLU SER LYS LYS 20

LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYE ASP LEU ARG ARG TRP GLU LYS TRP

GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PILE VAL HIS PRO ASN TYR SER 25LYS SER THR Till ASP ASH ASP iLE ALA LEU LEU JilS LEU ALA GLN PRO

30

35

40

45

47183008148

ALA TIIK LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEU PRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARC GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLU TIER LEU VAL THH GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARC GLU LYS GLU ALA LYS ARC ASN ARC THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VAL PRO HIS ASN GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASN MET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARC GLN ASP ALA CYS GLU GLY ASP SER CLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEU VAL CLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYR GLY VAL TYK THR LYS VAL SER ARC TҐR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HIS ILE ARC ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH

Таблица

Последовательности протеолитического расщепления для ассоциированных с клеткой протеаз

Источник

Рецептура инсулина

Белок С

Инсулин

Фактор X

Глюкагон

Белок С

Фактор Х

Фактор X

Активатор плазминогенной

Пептид с концевой аминог

Глюкагон

Пептид-вставка 1

CL PC.

Пептид-вставка 2

Последовательность (использование однобук- венной аббревиатуры)

PRPSPKRR KKRs HL НИ L EGSL }KR QTL ЕГчГОСК ML YQCSWQ QV LR-IRICR. Kit N RPKIl NILARYTR АЛРШЮАИ DQI:0,TEDKR QWL.MNTKU NRBDIAliR LVRGUGPvR IVEELGRI

Эукариотические клетки реципиенты

HepG-2

Гепатобластома АТС//НВ80б5

СУ-1

Почка африканской ATCC//CCL 70 зеленой обезьяны

Исходная LLC-MK.,

Производные от . LLC-MK

ЗТЗ

СНО-К1

Почка обезьяны макак

Почка обезьяны макак

Фибробласты мышиного эмбриона

Яичник Китайского хомя ка

ATCC/CCL 7

ATCC//CCL 7,1 Растет быстрее, чем АТСС/СС1 7

ATCC/CCL 92 ATCC//CCL 61

Необходимость пролин Из данного хозяина м быть образованы прои ные CIIO-K1, такие ка dhtv - производные Д

HeLa

RPM18226

Эпителоид шеи человека

Человеческая миелома

Гепатома крысы

ATCC/CCL 2

С1271 HS-Оолтан

ВНК-21

Мышиный фибро- бласт

ATCC//CCL 155 Секреция лёгкой цепи типа IgG лямбда

ATCC/CRL 1600 Из данного хозяина могут быть получены такие производные, как стойкие к 8-азагуанину клетки хозяева FAZA

ATCC//CRL 1616

Клетки человечес- ATCC//CRL И84

кой плазмы

Плазмоцитома

Почка детеныша хомяка

ATCC//CCL ТО

50

Таблица 2

В патенте США Ьл 393133 описывается использование данной клеточной линии

Необходимость пролина, Из данного хозяина могут быть образованы производные CIIO-K1, такие как dhtv - производные ДХВ11