Способ получения водорастворимой части человеческого рецептора малого сродства F @ Советский патент 1992 года по МПК C12N15/12 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к способам получения полипептидов, пригодных для борьбы с местными и системными аллергическими реакциями.

Способ включает следующие операции.

1.Выделение водорастворимой части связывающего IgE фактооа (Fcj R) из лимфобластоидных клеток.

2.Анализ последовательностей водорастворимой части человеческого рецептора РС малого сродства при помощи гидролиза,, выделение получаемых при этом фрагментов и определение их последовательностей.:

3. Приготовление двух проб гибридизации.

Проба 1: получение трансформирующей ячейки FcЈ +L дополнительной ДНК (далее дДНК) с использованием многостадийной циклической экстракции РНК, кодирующей полипептид (далее мРНК).

Проба 2: получение олигонуклеотидов формулы

тТдл

3 - ТТс ACCTAGTTGAAAc GT-5 А

кодирующих аминокислотную последовательность формулы

Lys-Trp-lfe-Asn-Phe-G fn.

х| Ю v|

сл

CJ

со

ICJ

4.Выделение генов, кодирующих человеческий рецептор FcЈ малого сродства, из матрицы РНК лимфобластоидных клеток, продуцирующих мРНК рецептора Fc , синтез дДНК с последующей идентификацией экспрессионных носителей, содержащих ген, кодирующий рецептор Fc, с использованием двух маркированных проб, содержащих специфичную к клеткам FcЈ R+L дДНК

и олигонуклеотид, общий с геном рецептора FcЈ малого сродства, и репликацией полученного таким образом гена рецептора FcЈ.

5.Экспрессия дДНК FcЈ R.

6.Определение гена, кодирующего че- ловеческий рецептор Fcg , с использованием дДНК, полученной из носителей согласно п. 5.

7.Экспрессия мРНК .

8.Получение вектора содержащего по- следовательности ДНК, кодирующие водорастворимый фрагмент рецептора FC-. , и его 0-гликозилированных производных, а также экспрессия этого растворимого фрагмента в микроорганизмах или клетках мле- копитающих.

Описанные выше операции проводят следующим образом.

1. Выделение и очистка водорастворимой части Fcf R.

Человеческие лимфобластоидные клетки В, например, клетки RPM1-8866, выделяют на поверхности Fc. R с молекулярной массой приблизительно 46 кд и отдают фрагмент с молекулярной массой приблизи- тельно 25 кд в надосадочную жидкость культуры. В результате проведения опыта с использованием связанного с энзимом им- муносорбента, выделяют два моноклональ- ных антитела (далее именуется метод эним). Активность Fc R, выделяемая лим- фобластоидными клетками RPM1 8866, выше в концентрированной надосадочной жидкости культуры, чем в солюбилизиро- ванных поверхностно-активным вещест- вом ПН-40 мембранных рецепторах, хотя для получения FcЈ R используют одинаковое количество, например, 105 клеток/мл. Кроме того, после хроматографии очищенных надосадочных жидкостей на по- лиакрилатном геле с использованием додецилсульфата натрия и элюации из геля активности Fc R обнаружена активность в областях 45-46 кд и 24-25 кд. При этом концентрированные надосадочные жидкости имеют более высокое содержание активности в области 25 кд. Поэтому в качестве источника рецептора используют бессывороточные надосадочные культу- ральные жидкости.

Очистку FCfR с молекулярной массой примерно 25 кд осуществляют в колонках, содержащих 10 мг/мл очищенного моно- клонального антитела, связанного с сефа- розными шариками. В результате последовательной адсорбции культураль- ной жидкости на связанной с альбумином сыворотки крупного рогатого скота сефа- розе и на связанной с мышиным иммуноглобулином сефарозе получают 70% первоначальной активности (без улучшения удельной активности). После предвари- тельной адсорбции рецепторному материалу дают связываться с сефарозой в течение 4-16 ч, при этом общая активность продукта элюации уксусной кислотой уменьшается, но удельная активность повышается до 83 ед/мкг и чистота увеличивается в 190 раз. В результате дальнейшей очистки рецептора хроматографией на колонне С-4 с обращенной фазой и использованием линейного градиента 0-65% ацетонитрила и 0,1 % трифторуксусной кислоты удельная активность повышается до 1630 ед/мкг и чистота рецептора увеличивается в 3710 раз. Однако степень извлечения составляет только 33% первоначального материала. Очистке подвергают и солюбилизированную поверхностно-активным веществом мембрану Fee R, но получаемая при этом удельная активность значительно меньше, чем при использовании культуральной надосадочной жидкости. Степень извлечения зависит от применяемого для элюации буфера, т.е. при осуществлении элюации 2,5%-ной уксусной кислотой с последующей быстрой нейтрализацией выход рецептора можно значительно повышать.

Очистка Fc R с использованием моно- клональных антител в твердой фазе является недостаточной для получения чистого рецептора. Поэтому после элюации Fc R подвергают дальнейшей очистке при помощи жидкостной хроматографии с обращенной фазой. При этом свежеэлюированный материал подают на колонку С-4 и подвергают хроматографии с использованием линейного градиента 0-65% ацетонитрила. Fc R элюируется ацетонитрилом при концентрации 44-45%.

Активность FcЈ R, получаемая в результате жидкостной хроматографии на колонке С-4, показывает одну полосу, соответствующую материалу с молекулярной массой 25 кд, который проявляет очень высокуюактив- ность при проведении анализа методом эним. Следует отметить, что полоса 25 кд соответствует меньшему виду Fc, R, который обнаруживается теми же моноклональными антителами после поверхностной иодинации и иммуноосаждения Fcw R с использованием тех же антител. Предполагается, что части с 46 и 25 кд являются антигенно идентичными, причем последняя представляет собой водорастворимую часть Ре,- R,

2. Анализ частичных последовательностей водорастворимой части .

Определяют последовательность аминокислотных остатков в с использованием трипсина илизилендопептидазы. При обработке трипсином получают 11 фрагментов, а при обработке лизилендопептида- зой - 12 фрагментов. Получались следующие фрагменты:

ш

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к способам получения полипептидов, пригодных для борьбы с местными и системными аллергическими реакциями. Сущность изобретения заключается в разработке способа получения водорастворимой части человеческого рецептора FcЈ малого сродства (FcЈ R). Способ включает выделение водорастворимой части связывающего IgE фактора (Fct R) из лимфобластоидных клеток, анализ ее последовательностей при помощи гидролиза, выделение получаемых при этом фрагментов и определение их последовательностей, приготовление двух проб гибридизации, выделение и идентификацию генов, кодирующих человеческий рецептор Рс малого сродства, экспрессию дДНК FcЈR, экспрессию мРНК FcЈ R, получение экспрессионного вектора, содержащего последовательности ДНК, кодирующие водорастворимый фрагмент рецептора FcЈ , экспрессию этого растворимого фрагмента в микроорганизмах или клетках млекопитающих. ё

Met-Glu-Leu-Gln-Val-Ser-Ser-Gly-Phe-Val-(N-KOw eeoU)j

Gly-Glu-Phe-Ile-Trp-Val-Asp-Gly-Ser-His-Val-Asp-Tyr-Ser-Asn- Trp-Ala-Pro-Gly-Glu-Pro-Thr-

Lys-His-Ala-Ser-His-Thr-Gly-Ser-Trp-Ile-Gly-Leu-Arg-Asn-Leu- ь/Г/Ь/ЛУ- LtiS - 20

и Lys - 7rp -jЈ& .jfn - pffg . #Јf 3. Получение проб гибридизации.

Проба 1 (дДНК, специфичная относительно L-клеток, положительных в отношении Fc R).

Клетки L, имеющие недостаток тими- дин-киназы (далее ТК), например, клетки LtK , подвергают трансфекции высокомолекулярной ДНК из клеток RPM1-8866 и ТК. геном из вируса Герпес-симплекс. После селекции HAT ТК положительные трансформанты обрабатывают биотинированным анти-FCf R антителом (8-30) и FITC-авиди- ном и классифицируют. В результате получают две трансформированные клетками L линии. L-V-8-30 и L-VI-8-30.

РНК получают из клеток L-V-8-30 с использованием гуанидина изотиоцианата и хлорида цезия. .ДНК, дополнительную к мРНК из клеток L-V-8-30, синтезируют обратной транскриптазой на олиго/ЬТ/прай- мере.дДНКпутем введения маркированной альфа- Р-деокси-СТР гибридизируют с 10- кратным избытком поли/А/+-РНК, полученной из клеток LtK. Реакционную смесь наносят на колонку с оксиапатитом. Не связанную однонитевую дДНК подвергают повторной гибридизации с поли/А/+-РНК, полученной из клеток LtK. Первую нить дДНК, специфичную в отношении трансформантов клеток L, положительных относительно Fc R, используют в качестве пробы для обнаружения гена для Fc. R в ламбда-дт-Ю-библиотеке.

Проба 2: синтез смеси олигонуклеоти- дов формулы

5

0

5

0

5

0

5

3- ТТсТАСС TAGTTGAAAGAGT-5 А

Этот огигонуклеотид используют в качестве пробы для обнаружения гена для Fc -рецептора.

мРНК выделяют из клеток RPM1-8866 путем центрифугирования в градиенте хлористого цезия, экстракции фенолом и осаждения этанолом. Поли/А/ -РНК выделяют хроматографией на олиго/оТ/целлюлозе.

Поли/А/+-РНК используют в качестве матрицы для получения дДНК с помощью обратной транскрилтазы и олиго/оТ/прай- мера. После обработки RN азой Н вторую нитку ДНК синтезируют при помощи ДНК полимеразы 1. ДНК модифицируют при помощи Т4-ДНК-полимеразы с тем, чтобы удалить остаток З -выступов из первой нити ДНК и лигируют в EcoRI-линкере. дДНК 1 длиной более 1000 п,о. фракционируют и избыток линкеров удаляют хроматографией на колонке. дДНК клонируют в ДНК лямбда- д110фага по сайту EcoR1 и трансформируют в штамм 0600 hfe Escherichla coli.

Гибридизацией колоний идентифицируют те, которые специфичны в отношении FcЈR. При этом используют указанные выше пробы.

Отбирают 23 из примерно ЗООООС клонов, которые гибридизируются с обеими . пробами.

Вставку EcoR1, содержащую дДНК для FCi R и выделенную из описанного лямбда gtiO клона, лигируют с переваренным EcoR1 плазмидным вектором рСЕМ- 4, обозначенным LE392. Этот вектор содержит два промотора SP6 и Т7 в противоположной друг другу ориентации, дДН К для FccR можно сразу же транскрибировать в мРНК. дДНК переваривают ВатН1 и полученную ДНК применяют в качестве матрицы для синтеза мРНК при помощи SP6 РНК-пол- имеразы. Полученную РНК впрыскивают в ооциты Xenopus. После двухдневной инкубации ооциты лизируют и определяют нали- чие Fc R методом эним с использованием двух анти-FCgR антител 3-5 и 8-30, которые распознают различные эпитопы на FcЈp. В доказательство того, что pFcЈ R-1 содержит всю кодирующую последовательность FcЈR,

51015

Met Glu Glu Gly Gin Туг Ser Glu lie Glu Glu Leu Pro Arg Arg ATG GAG GAA GGT CAA TAT TCA GAG АТС CTT CCC AGG AGG TAG CTC CTT CCA GTT ATA ACT CTC TAG CTC CTC GAA GGG ТСС ТСС

20 2530

Arg Cys Cys Arg Arg Gly Thr Gin lie Val Leu Leu Gly LeuVal

CGG TGT TGC AGG CGT GGG ACT CAG АТС GTG CTG CTG GGG CTGGTG

GCC АСА ACG TCC GCA CCC TGA GTC TAG CAC GAG GAG CCC GAGCAC

35 4045

Thr Ala Ala Leu Trp Ala Gly Leu Leu Thr Leu Leu Leu LeuTrp

ACC GCC GCT CTG TGG GCT GGG CTG CTG ACT CTG CTT CTC CTGTGG

TGG CGG CGA GAG ACC CGA CCC GAG GAG TGA GAG GAA GAG GAGACC

50 5560

His Trp Asp Thr Thr Gin Ser Leu Lys Gin LeuGlu Glu Arg Ala

CAC TGG GAC ACC АСА CAG AGT СТА ААА CAG CTGGAA GAG AGG GCT

GTG ACC CTG TGG TGT GTC TCA GAT TTT GTC GACCTT CTC TCC CGA

657075

Ala Arg Asn Val Ser Gin Val Ser Lys Asn Leu Glu Ser His His GCC CGG AAC GTC TCT CAA GTT TCC AAG AAC TTG GAA AGC CAC CAC CGG GCC TTG CAG AGA GTT CAA AGG TTC TTG AAC CTT TCG GTG GTG

808590

Gly Asp Gin Met Ala Gin Lys Ser Gin Ser Thr Gin lie Ser Gin GGT GAC CAG ATG GCG CAG AAA TCC CAG TCC ACG CAG ATT TCA CAG CCA CTG GTC TAG CGC GTC TTT AGG GTC AGG TGC GTC TAA AGT GTC

95100105

Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala Glu Gin Gin Arg Leu Lys Ser Gin GAA CTG GAG GAA CTT CGA GCT GAA CAG CAG AGA TTG AAA TCT CAG CTT GAC CTC CTT GAA GCT CGA CTT GTC GTC TCT AAC TTT AGA GTC

110115120

Asp Leu Glu Leu Ser Trp Asn Leu Asn Gly Leu Gin Ala Asp Leu GAC TTG GAG CTG TCC TGG AAC CTG AAC GGG CTT CAA GCA GAT CTG CTG AAC CTC GAC AGG ACC TTG GAC TTG CCC GAA GTT CGT СТА GAC

применяют вектор pDE2, который содержит оба SV40 ранних промотора в противоположной друг другу ориентации,обеспечива- ющий экспрессию дДНК в обоих направлениях. Сегмент ДНК между обоими S40 ранними промоторами удаляют гидролизом эндонуклеазой EcoR1 и заменяют на вставку дДНК pFcЈ R-1/pDE2-FcЈ R-1/. Клетки Cos7 трансфецируют рОЕ2-дДНК FcЈ R. Анализ показывает, что 30% трансфеци- рованных клеток подтверждает, что дДНК кодирует молекулу Fc R.

Полная нуклеотидная последовательность и связанная с ней последовательность аминокислотных остатков представлены ниже. При этом кодирующая последовательность имеет следующую формулу:

125130135

Ser Ser Phe Lys Ser Gin Glu Leu Asn Glu Arg Asn Glu Ala Ser AGC AGC TTC AAG TCC GAG GAA TTG AAC GAG AGG AAC GAA GCT TCA TCG TCG AAG TTC AGG GTC CTT AAC TTG CTC TCC TTG CTT CGA AGT

140145 150

Asp Leu Leu Glu ArgLeu Arg Glu Glu Val Thr Lys Leu Arg Met

GAT TTG CTG GAA AGACTC CGG GAG GAG GTG АСА AAG СТА AQG ATG

СТА AAC GAG CTT TCTGAG GCC CTC CTC CAC TGT TTC GAT TCC TAG

155160165

Glu Leu Gin Val Ser Ser Gly Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu GAG TTG CAG GTG TCC AGC GGC TTT GTG TGC AAC ACG TGC CCT GAA CTC AAC GTC CAC AGG TCG CCG AAA CAC ACG TTG TGC ACG GGA CTT

170175- -180

Lys Trp lie Asn Phe Gin Arg Lys Cys Туг Туг Phe Gly Lys Gly AAG TGG АТС AAT TTC CAA CGG AAG TGC TAG TAG TTC GGC AAG GGC TTC ACC TAG TTA AAG GTT GCC TTC ACG ATG ATG AAG CCG TTC CCG

185190195

Thr Lys Gin Trp Val His Ala Arg Tyr Ala Cys Asp Asp Met Glu ACC AAG CAG TGG GTC CAC GCC CGG TAT GCC TGT GAC GAG ATG GAA TGG TTC GTC ACC CAG GTG CGG GCC ATA CGG АСА CTG CTG TAG CTT

200205210

Gly Gin Leu Val Ser lie His Ser Pro Glu Glu Gin Asp Phe Leu GGG CAG CTG GTC AGC АТС CAC AGC CCG GAG GAG CAG GAC TTC CTG CCC GTC GAC CAG TCG TAG GTG TCG GGC CTC CTC GTC CTG AAG GAC

215220225

Thr Lys His Ala Ser His Thr Gly Ser Trp lie Gly Leu Arg Asn ACC AAG CAT GCC AGC CAC ACC GGC TCC TGG ATT GGC CTT CGG AAC TGG TTC GTA CGG TCG GTG TGG CCG AGG ACC TAA CCG GAA GCC TTG

230235240

Leu Asp Leu Lys Gly Glu Phe lie Trp Val Asp Gly Ser His Val TTG GAC CTG AAG GGA GAG TTT АТС TGG GTG GAT GGG AGC CAT GTG AAC CTG GAC TTC CCT CTC AAA TAG ACC CAC СТА CCC TCG GTA CAC

245250255

Asp Tyr Ser Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Thr Ser Arg Ser Gin GAC TAC AGC AAC TGG GCT CCA GGG GAG CCC ACC AGC CGG AGC CAG CTG ATG TCG TTG ACC CGA GGT CCC CTC GGG TGG TCG GCC TCG GTC

260 265270

Gly Glu Asp Cys Val Met Met Arg Gly SerGly Arg Trp Asn Asp

GGC GAG GAC TGC GTG ATG ATG CGG GGC TCCGGT CGC TGG AAC GAC

CCG CTC CTG ACG CAC TAC TAC GCC CCG AGGCCA GCG ACC TTG CTG

275280285

Ala Phe Cys Asp,Arg Lys Leu Gly Ala Trp Val Cys Asp Arg Leu GCC TTC TGC GAC CGT AAG CTG GGC GCC TGG GTG TGC GAC CGG CTG CGG AAG ACG CTG GCA TTC GAC CCG CGG ACC CAC ACG CTG GCC GAC

290295300

Ala Thr Cys Thr Pro Pro Ala Ser Glu Gly Ser Ala Glu Ser Met GCC АСА TGC ACG CCG CCA GCC AGC GAA GGT TCC GCG GAG TCC ATG CGG TGT ACG TGC GGC GGT CGG TCG CTT CCA AGG CGC CTC TAC

305310315

Gly Pro Asp Ser Arg Pro Asp Pro Asp Gly Arg Leu Pro Thr Pro GGA CCT GAT TCA AGA CCA GAC CCT GAG GGC CGC CTG CCC ACC CCC CCT GGA СТА ACT TCT GGT CTG GGA CTG CCG GCG GAC GGG TGG GGG

Ser Ala Pro Leu His Ser TCT GCC CCT CTC CAC TCT TGA AGA CGG GGA GAG GTG AGA ACT

Большое количество растворимого с молекулярной массой 25 кд обнаруживается в культуральной надосадочной жидкости клеток RPM1-8866. N-концевой аминокислотный остаток (Met) растворимого Fc,,R находится в положении 150. Предыдущий остаток, аргинин, представляет собой обычную мишень для протеаз, подобных трипсину. С-концевая область (150-321) содержит две группы цистеина (160, 163, 174 и 191 и 259, 273, 282 и 288), которые, вероятно, образуют дисульфидные связи и представляют собой структуру, устойчивую к воздействию протеолитических энзимов. Поэтому С-концевая область (150-321) соответствует растворимому Fcr R, который представляет собой продукт протеолитиче- ского расщепления связанного с мембраной FcgR.

Поли/А/ 1 -РНК получают из клеток различного типа и анализируют на экспрессию

Met ATG TAG

Glu Leu Gin Val Ser Ser Gly Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu GAG TTG CAG GTG TCC AGC GGC TTT GTG TGC AAC ACG TGC CCT GAA CTC AAC GTC CAC AGG TCG CCG AAA CAC ACG-TTG TGC ACG GGA CTT

Lys Trp lie Asn Phe Gin Arg Lys Cys Туг Туг Phe Gly Lys Gly AAG TGG АТС AAT TTC CAA CGG AAG TGC TAG TAG TTC GGC AAG GGC TTC ACC TAG TTA AAG GTT GCC TTC ACG ATG ATG AAG CCG TTC CCG

Thr Lys Gin Trp Val His Ala Arg Tyr Ala Cys Asp Asp Met Glu ACC AAG CAG TGG GTC CAC GCC CGG TAT GCC TGT GAC GAC ATG GAA TGG TTC GTC ACC CAG GTG CGG GCC ATA CGG АСА CTG CTG TAG CTT

Gly Gin Leu Val Ser He His Ser Pro Glu Glu Gin Asp Phe Leu GGG CAG CTG GTC AGC АТС CAC AGC CCG GAG GAG CAG GAC TTC CTG CCC GTC GAC CAG TCG TAG GTG TCG GGC CTC CTC GTC CTG AAG GAC

Thr Lys His Ala Ser His Thr Gly Ser Trp He Gly Leu Arg Asn ACC AAG CAT GCC AGC CAC ACC GGC TCC TGG ATT GGC CTT CGG AAC TGG TTC GTA CGG TCG GTG TGG CCG AGG ACC TAA CCG GAA GCC TTG

Leu Asp Leu Lys Gly Glu Phe He Trp Val Asp Gly Ser His Val TTG GAC CTG AAG GGA GAG TTT АТС TGG GTG GAT GGG AGC CAT GTG AAC CTG GAC TTC CCT CTC AAA TAG ACC CAC СТА CCC TCG GTA CAC

мРНК для FcЈ R. Основную полосу длиной 1700 оснований обнаруживают в В лимфоб- ластоидных клеточных линиях (RPM1-8866 и RPM1-1788), рге В клеточной линии FL # 8-2 и в двух трансформантах FcЈ R+L клетки, но не в клетках Fc-R, включающих две линии лимфомы, Т клеточной линии (СЕМ) и в трансформантах клетки, которых экспримируют другой В клеточный антиген (CD20). Кроме того, мРН К для не обнаруживается в обычных Т клетках, тогда как обычные В клетки экспрессируют такое же количество мРНКдля РсЈР, что и В лимфоб- ластоидные линии.

Водорастворимая часть рецептора содержит по крайней мере следующую последовательность:

Asp Туг Ser Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Thr Ser Arg Ser Gin GAG TAG AGC AAC TGG GCT CCA GGG GAG CCC ACC AGC CGG AGC GAG CTG ATG TCG TTG ACC CGA GGT CCC CTC GGG TGG TCG GCC TCG GTC

Gly Glu Asp Cys Val Met Met Arg Gly Ser Gly Arg Trp Asn Asp GGC GAG GAG TGC GTG ATG ATG GGG GGC TCC GGT CGC TGG AAC GAG CCG CTC CTG ACG CAC TAG TAG GCC CCG AGG CCA GCG ACC TTG CTG

Ala Phe Cys Asp Arg Lys Leu Gly Ala Trp Val Cys Asp Arg Leu GCG TTC TGC GAG CGT AAG CTG GGC GCC TGG GTG TGC GAG CGG CTG CGG AAG ACG CTG GCA TTC GAG CCG CGG ACC CAC ACG CTG GCC GAG

Ala Thr Cys Thr Pro Pro Ala Ser Glu Gly Ser Ala Glu Ser Met GCC АСА TGC ACG CCG CCA GCC AGC GAA GGT TCC GCG GAG TCC ATG CGG TGT ACG TGC GGC GGT CGG TCG CTT CCA AGG CGC CTC AGG TAG

Gly Pro Asp Ser Arg Pro Asp Pro Asp Gly Arg Leu Pro Thr Pro GGA CCT GAT TCA AGA CCA GAG CCT GAG GGC CGC CTG CCC ACC CCC CCT GGA СТА AGT TCT GGT CTG GGA CTG CCG GCG GAG GGG TGG GGG

Ser Ala Pro Leu His Ser TCT GCC CCT CTC CAC TCT TGA AGA CGG GGA GAS GTG AGA ACT

Включающая мембрану область не работает в качестве сигнальной последовательности в обычных рекомбинантных процессах. Поэтому для выделения водорастворимого протеина из подходящего хозяина необходимо применение эукари- отной сигнальной последовательности. Такая сигнальная последовательность может применяться дополнительно и в положении перед дДНК, кодирующей водорастворимую часть.

Получают новый рекомбинантный водорастворимый фрагмент, имеющий по крайней мере одно место 0-гликозилирования, а также новые плазмиды, содержащие эти последовательности ДНК, и psFc R-1.

Получают последовательность дДНК, в которой дДНК по крайней мере для части аминокислот 1-148 франментэ отсутствует, так что имеются только последовательность, кодирующая часть протеина мембраны, и часть, кодирующая водорастворимый фрагмент дДНК всего рецептора.

Часть последовательности дДНК, кодирующей аминокислоты 1-148, заменена на подходящий фрагмент дДНК, кодирующий эукариотную сигнальную последовательность.

EcoR1 BamH1 вставку дДНКВ5Р-2 длиной 1,2 т.п.о. получают путем переваривания pBSF-2.38 с помощью Hindlll и ВатШ. Полученный фрагмент, содержащий всю дДНК BSF-2, подвергают перевариванию с помощью Hinfl и З -концы обрабатывают

5

0

5

0

5

0

5

фрагментом Кленова ДНК полимеразы. После переваривания с помощью Kpnl полученный фрагмент Kpnl-Hinf длиной 110 п.о., содержащий доминантную последовательность BSF-2, клонируют в pGEM4 после переваривания с помощью Kpnl и Smal. Один из отобранных клонов размножают и обозначают как pBSF2-L8. pBSF2-L8 подвергают перевариванию с помощью ВатН1 и 3 -концы обрабатывают фрагментом Кленова ДНК полимеразы. Переваренную Hindlll и Pstl, дДНК FcЈR клонируют в переваренный ВатН1 и Pstl pBSF2-L8. Один из отобранных клонов размножают и обозначают как .

С целью сравнения биологической активности протеинов, полученных клонами pFcЈ R-I, рзРс R-1, p ANFcЈ R-1 и pANFcrR-2, плазмиды подвергают линеаризации перевариванием с помощью подходящих энзимов, например, и psFo. R-1 с помощью BamH1, a p A NFc€ R-1 и p A NFcg R-2 - с помощью EcoR1. Полученные фрагменты применялись в качестве матрицы для синтеза мРНК с использованием SP6 РНК полимеразы. Полученные мРНК впрыскивают в ооциты xenopus leavis. После двухдневного инкубирования активность FC, R в кутуральных надосадочных жидкостях и лизатах ооцитов определяют методом эним с использованием анти-FcjR антител 3-5 и 8-30, которые распознают два различных эпитопа на FCgR. В лизатах РВ и культуральной надосадочной жидкости

io

ооцитов, в которые впрыскивают транскрипты . pANFcЈR-1 npANFcЈR-2, активность не обнаруживают, тогда как активность FcЈ R определяется в надосадоч- ных жидкостях и лизатах PBS после впрыскивания фрагментов pSFcgR-1.

Водорастворимый фрагмент FcЈ R из ооцитов проявляет способность к связыванию иммуноглобулина Е при помощи модифицированного метода эним, заключающегося в использовании анти-Fc R-ан- тител 3-5, иммуноглобулина Е и человеческого АР-антииммуноглобулина. При этом надосадочная жидкость ооцитов, в которые впрыскивали мРНК pSFc R-1, инкубируют на покрытых антителом 3-5 пластинах, которые затем последовательно инкубируют с человеческим иммуноглобулином Е и АР-антииммуноглобулином Е. Выделившийся из ооцитов фрагмент Fc R образует комплекс с иммуноглобулином Е. В качестве контроля проводят связывание с нетрансформированной надосадочной жидкостью из ооцитов, буфером и надосадочной жидкостью из клеток RPM1-8866.

Надосадочную жидкость ооцитов подвергают дальнейшему опыту по определению способности к торможению образования розеток между фиксированным ох РВС, покрытым человеческим иммуноглобулином Е, и клетками SKW6-CL4, несущими FCg R на своей поверхности.

Последовательность FcЈR экспрессиро- вать под контролем промотора бактериофага Lambda/Pi/.

EBI-496:

5 GAACTGCAGGTGAGCTCTGGTTTCGTTTGCAACACTTGCCCGGAAAAATG

EBI-497:

3 CTTGACGTCCACTCGAGACCAAAGCAAACGTTGTGAACGGGCCTTTTTACCTAG 5

Sau ЗА

с тем, чтобы восстановить соответствующие кодоны формул

GluLeuGlnValSerSerGlyPheVfelCysAsnThrCysProGluLygTrp 5 GAACTGCAGGTGAGCTCTGGTTTCGTTTGCAACACTTGCCCGGAAAAATGЭ

3 CTTGACGTCCACTCGAGACCAAAGCAAACGTTGTGAACGGGCCTTTTTACCTAG 5

ЗаиЗА

16

Чувствительный к температуре аллель этого репрессорного гена может включать вектор, который содержит полную последовательность Рс R. Если температуру повышают до 42°С, то репрессор инактивируется и промотор экспримируется на своем максимальном уровне.

Могут применяться системы промотор - оператор или их части, например арабиноз- ный оператор, колицин-Еч-оператор, галак- тозный оператор, щелочной фосфатазный оператор, трп-оператор, кисксилозный А- оператор, tac-оператор и другие.

Плазмиду pRH 100 переваривают с по5 мощью Sstl. Затем З -выступы удаляют и линеаризованную плазмиду подвергают де- фосфорилированию. После экстракции фенолом и хлороформом, электрофореза, электроэлюации и осаждения линеаризо0 ванный вектор лигируют со вставкой, получаемой следующим образом.

Ллазмиду pGEM4-FcЈR, полученную перевариванием EcoRI-вставки плазмиды LE 392 с Hindlll и повторного введения в

5 pGEM4 длинного фрагмента EcoR1 и Hindlll, переваривают с EcoR1 и Hindlll. Затем выступающие 5 -концы затупляют с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1, после чего 5 -фосфатные группы удаляют. После

Q очистки полученный фрагмент гидролизуют Sau ЗА и больший фрагмент выделяют. Так как в результате этой операции удаляют не только 5 -область, но и нуклеотиды для первых Nконцевых аминокислот водорастворимой части, синтезируют два олигодеоксинуклео5 тида формул

17

(без кодона ATG, так как он содержится в промоторно-операторно-линкерной системе плазмиды pER 103).

Вставки лигируют с линеаризованным вектором ДНК и трансформируют в E.coli НВ101, отбирают устойчивые к ампициллину колонии. Плазмиды исследуют путем рестрикционного анализа. Плазмиду отбирают и обозначают как рРН 246.

Дополнительно к прокариотам могут применяться дрожжевые культуры.

Гены водорастворимой части человеческого рецептора Fc€R с аминокислотами 150- 321 можно экспрессировать в дрожжах, если применять ADH1-промотор вместе с ADH1- терминатором. Дрожжевой экспрессионный вектор можно получать за счет получения:

а)плазмиды, содержащей дрожжевой ADH1-терминатор;

б)плазмиды, содержащей дрожжевой ADHI-промотор и дрожжевой АОШ-терми- натор;

в)плазмиды, содержащей дрожжевой ADHI-промотор, ген, кодирующий дрожжевую доминантную последовательность MF а , мультиклонирующее место и дрожжевой ADH1-терминатор;

г)плазмиды, содержащей ADHI-промотор, последовательность, кодирующего водорастворимую часть человеческого рецептора FC...R малого сродства, и АОН1-терминатор;

д)трансформации полученной плазмид- ной ДНК в дрожжевом векторе.

При этом получают плазмиду, содержащую экспрессионную кассету без доминантной последовательности MFa, и плазмиду, содержащую экспрессионную кассету с доминантной последовательностью MFa.

Операции проводятся следующим образом.

a) ADH1-терминатор выделяют из плазмиды plD14. ADHI-терминатор субклониру- ют в плазмиде pUC18 по сайтам Hindlll и

IНазвание

MF I TCGAGCCTCATATCAATGAGATTCCCATCTATTTTCACTGCTGTTTTGTT (50-меР)

КР 2 AGCAGCGAACAAAACAGCAGTGAAAATAGATGGGAATCTCATTGATA fGA GGC (53-Мср)

MF 3 CGCTGCTTCCTCCGCTTTGGCTGCTCCA oTCAACACTACTACTGAAGACG AAACTGCTCAAATTCCAGCT (70 -мер)

72753318

Sphl и получают плазмиду pWS 214S4. По- еле гидролиза pWS 214S4 рестриктазами Sphl и Sail меньший фрагмент выделяют электрофорезом в агарозном геле. 5Фрагмент, содержащий ADHI-терминатор, подвергают лигированию с векторной ДНК, полученной перевариванием Bluescribe M13 рестриктазами Sail и Sphl с последующей очисткой электрофорезом в 10 агарозном геле.

Лигированную ДНК трансформируют в E.coli IM101 и отбирают колонии, устойчивые к ампициллину. Плазмиду этих колоний обозначают как pRH241. Эта плазмида со- 15 держит имеющий примерно 340 п.о. фрагмент с АОН1-терминатором.

б)АОН1-промотор выделяютиз плазмиды pY-IDB-HulFN-омега-Т, т.е. плазмиды для получения человеческого интерферона 20 омега 1. Плазмиду переваривают рестрикта- зой Sphl, затем удаляют З -выступ с использованием ДНК полимеразы 1 в присутствии dGTP и повторно гидролизуют рестрикта- зой Xho1. Электрофорезом в агарозном геле 25 выделяют фрагмент размером 400 п.о. и подвергают его легированию с адапторной парой формулы

ЕВ 1-410: 5 AATTGGAAGGATC 3 ЕВ 1-429: 3 CCTTCCTAG-p5

В липкий конец лигируют с адапторной парой формулы ЕВ 1-418: 5 p-TCGAGCACGTGGTAC 3 ЕВ 1-424: 3 CGTGCAC5

Реакции лигирования проводят одновременно. После очистки электрофорезом в ага- 35 розном геле ДНК лигируют с ДНК плазмиды pRH241 по сайтам EcoR1 и Крп1 и трансформируют ее в E.coli. Колонии исследуют на наличие плазмиды с правильной конструкцией, которую обозначают как pRH242. до в) Химический синтез пептида MFa осуществляют с использованием предварительно синтезированных олигонуклеотидов:

Последовательность

30

172753320

MF 4 CAGCTTCAGCTGGAATWGAGCAGTTTCGTCTTCAGTAGTAGTGTTGACT

GGAGCAGCCAAAGCGGAGGA {7О-мвр)

MF 5 GAAGCTGTCATCGGTTACTCTGACTTGGAAGGTGACTTCGACGTTGCT (48 -wet)

MF 6 GCAAAACAGCAACGTCGA.GTCACCTTCCAAGTCAGAGTAACCGATGA (48 -мет)

MF 7 GTTTTCCCATTCTCCAACTCCACTAACAACGGTTTGTTGTTCATTAAC ACTACTATTGCATCGATTGCT (69-иеТ) )

MF 3 CCTTAGCAGCAATCGATGCAATAGTAGTGTTAATGAACAACAAACCGTTG TTAGTGGAGTTGGAGAATG { 69-мер )

MF 9 GCTAAGGAAGAAGGTGTTTCTTTGGACAAGAGGCCTCTGCAGGAATTCT (49-Uej)

MF 10 CTAGAGAATTCCTGCAGAGGCCTCTTC-TCCAAAGAAACACCTTCTT

(46-A/ep)

Олигонуклеотиды MF2 - MF9 подвергают фосфорилированию. После прекращения реакции путем нагревания получают следующие смеси: MF1 и MF2; MF3 и MF4; MF5 и MF6; MF7 и MF8; MF9 и MF10. После нагревания и охлаждения пять растворов объединяют и лигируют. К полученному раствору добавляют линеаризованную ДНК плазмиды pRH 242, полученную путем переваривания с помощью Xho1 и ХЬа1 и последующей очистке электрофорезом. Раствор лигируют и трансформируют в E.coli IM101. Плазмиды полученных колоний исследуют путем переваривания с помощью Xho1 и ХЬа1. При этом те плазмиды, которые содержат вставку длиной примерно 290 п.о. клонируют с М13мр8 с последующим анализом последовательностей. Плазмиду, содержа

ATG GAA TTG CAA GTT ТСС ТСТ ACT TGT CCA GAA AAG TG

CTT AACGTT CAA AGG AGA CCA

АСА GGTCTT TTC ACC TAG ISau3A

щую правильную вставку, отбирают и обозначают как pRH243.

г) Последовательность, кодирующую водорастворимую часть человеческого рецептора FcЈ R малого сродства, выделяют из плазмиды pGEM4 путем переваривания с помощью Hindlll и EcoR1 и липкие концы дополняют с использованием фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 из E.coli. Большой фрагмент подвергают фефосфорилиро- ванию и очистке, а затем гидролизуют с помощью SauSA. Так как при этом удаляется не только 5 -область, но и нуклеотиды первых 18 N-концевых аминокислот водорастворимого фрагмента, начиная с аминокислоты 150, синтезируют два олгино- деоксинуклеотида

21172753322

с тем, чтобы восстановить полный ген с ис-пользованием дрожжевого кодона формулы

Met 5 TCGAGCTCATATACA АТС

3 CGAGTATATGT TAG

Xhol

155160165

Glu Leu Gin Val Ser Ser Gly Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu GAA TTG CAA GTT TCC TCT. GGT TTC GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA CTT AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG CAA АСА TTG TGA АСА GGT CTT

Trp TG ACC TAG Sau3A

3 5

Полученные олигонуклеотиды ренату- рируют и лигируют с фрагментом SauSA и EcoRf с использованием лигазы Т4 ДНК.

Вставку лигируют ДНК, плазмиды pRH242 по сайтам ХЬа1 и Xho1 и трансформируют в E.coli IM101. Плазмиды полученных колоний исследуют при помощи рестрикционного анализа. Плазмиду, содержащую правильную вставку, отбирают и обозначают как pRH244.

д) Последовательность, кодирующую водорастворимую часть человеческого рецептора Fc R малого сродства, выделяют из

EBI-430:

5 ATGGAATTGCAAGTTTCCTCTGGTTTC ATG GAA TTG CAA GTT TCC TCT GGT TTC GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA AAG TG

EBI-437:

3 TACCTTAACGTTCAAAGGAGACCAAAG TAG CTT AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG CAA АСА TTG TGA АСА GGT CTT TTC ACC TAG 5

Sau3A

i.

с тем, чтобы восстановить полный ген с ис-пользованием дрожжевого кодона формулы

I

50Met

5 ATG

3 TAG

Glu Leu Gin Val Ser Ser Gly Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu GAA TTG CAA GTT TCC TCT GGT TTC GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA CTT AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG CAA АСА TTG TGA АСА GGT CTT

I

плазмиды pGEM4-FCgR путем переваривания с помощью Hindlll EcoR1 и концы дополняют с использованием фрагмента Кленова ДНК полимеразы 1 из E.coli. Меньший фрагмент подвергают дефосфорилированию и очистке. Так как Hindlll режет дДНК FcЈR примерно 50 п.о. после первой аминокислоты, вставку подвергают гидролизу с помощью SauSA. Так как при этом удаляют не только 5 -область (в направлении конца), но и нук- леотиды первых 18 N-концевых аминокислот водорастворимого фрагмента, синтезируют два олигонуклеотида формул

Trp TG ЛСС TAG Sau3A

31 5

Олигонуклеотиды ренатурируют, фрагмент SauSA к EcoR1 добавляют и подвергают лигированию с помощью ДН К лигазы Т4. Полученный фрагмент подвергают очистке путем электрофореза, электроэлюции и эсаждения известными методами.

Вставку лигируют с ДНК плазмиды pRH243 по сайтам EcoFM, и Stul и трансформируют в E.coli IM101. Полученные колинии исследуют с помощью рестрикционного анализа. Плазмиду, содержащую правильную вставку, отбирают и обозначают как PRH245.

е) Плазмиды pRH244 и pRH245, состоящие из промотора ADH1, доминантного гена MFa (только в случае рРН245), водорастворимого гена FcgR и терминатора ADH1, гидролизуютрестриктазамиШпсЛН и BamHI и лигируют с дрожжевой плазмидой рЮВ207или YEp13.

Плазмиду LE392 или pGEM4 (pFct R-1) переваривают при помощи Hindlll и EcoRL Фрагмент ДНК, начинающийся с нуклеоти- да 584, клонируют в плазмиду pGEM4, по сайтам Hindlll и EcoRL Один из отобранных клонов размножают и обозначают как pANFc R-1.

Плазмиду LE392 или pGEM4 (pFcЈ R-1) гидролизуют с помощью EcoR1 и получают фрагмент, содержащий дДНК длиной примерно 1,7 т.п.о (Fc-R). Полученный фрагмент частично переваривают с помощью SauSA с тем, чтобы удалить последовательность дДНК, кодирующую цитоплазменный домен, например, для аминокислот 1-23, и фрагмента дДНК, начинающего с нуклеоти- да 254, лигируют с 26-мерным линкером формулы

5 -GATCTGAGTCATGGTACCATGACTCA-3 с тем, чтобы восстановить стартовый кодон АТС на б -конце и рестрикциейное место Крп1. Лигированный фрагмент клонируют в плазмиду pGEM4 по сайтам Крп1 и EcoRL Путем гибридизации отбирают клоны, у которых область предположительного цитоп- лазменного домена отсутствует. Один клон отбирают, размножают и обозначают как р A NFCgR-2.

Общие материалы и методы.:

Моноклональные анти-Fc R антитела 3- 5 (yi ) и 8-30 ( /г) получались путем гибри5

дизации P3U1 миеломы с клетками мышиной селезенки, иммунизированными клетками RPM1-8866. Антитело 8-30 рас- , познает эпитоп, смежный с местом связывания иммуноглобулина рецептора FcЈ , и может блокировать связывание иммуноглобулина с лимфобластоидными клетками 8866. Антитело 3-5 распознает другой эпиQ топ на и не может эффективно блокировать связывание иммуноглобулина с его рецепторами. Эти антитела осаждают в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях полипептиды с молекулярной массой 46 кд и 25 кд. Моноклональные антитела очищают путем осаждения 50%-ным насыщенным сульфатом аммония и последующей гелевой фильтрации с использованием се- фарозы 6В (в случае иммуноглобулина М)

Q или ионнообменной хроматографии с использованием сефадекса (в случае иммуноглобулина С1). Поликлониальный мышиный иммуноглобулин G выделяюттаким же образом.

Предварительно очищенный материал

5 FcЈR подают на колонку, уравновешенную водой, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты, и элюированную линейным градиентом ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты. При этом ацето0 нитрил применяют в количестве 0,5 мл/мин с соблюдением линейного градиента от 0 до 65% в течение 60 мин. Элюированный материал замораживают и лиофилизируют перед исследованием на активность методом эним.

5

0

5

0

5

Синтезированные олигодеоксинуклео- тиды очищают путем электрофореза на по- лиакриламидном геле.

П р и м е р А. Получение плазмиды pY- IDB-HulFN-OMeraL

а)Получение дрожжевого промотора ADH1.

8 мкг плазмиды рЁЗЮЗ переваривают с BamHI иХгю1 в500мкл раствора. Промотор длиной около 1450 п.о. отделяют в 1%-ном агаровом геле и осаждают. Фрагмент суспендируют в 40 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис, 1 мМ этилендиаминотетрауксусной кислоты (далее ЭДТУ), рН 8). Плазмиду рЕЗЮЗ получают за счет введения в pUC18 переваренной BamHI и Xho1 плазмиды АХ 11 длиной около 1450 п.о.

б)Подготовка вектора рЮВ207.

10 мкг рЮВ207 линеаризуют при помощи BamHL С целью предотвращения последующего повторного связывания удаляют) 5 -концевые фосфатные группы путем обра- ботки фосфатазой кишечника теленка. Линейную форму отделяют в 1 %-ном агаровом,

25

геле от неразрезанной плазмиды. Полученный вектор ДНК растворяют в 20 мкл ТЕ-бу- фера.

в)Экспрессионный вектор для интерферона типа омега 1.

50 мкл плазмиды pRHW12 линеаризируют при помощи Hindlll, обрабатывают фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1 и очищают путем электрофореза в агаровом геле. Для получения соединяющихся с промотором концов к концам линейного pRHW12 присоединяют линкер Хпо1.

Путем обработки 100 единицами Хпо1 освобождают специфические относительно Xho1 клейкие 5 -выступы, Снабженный Xhol-концами линейный pRHW12 очищают путем электрофореза в агаровом геле, добавляют 5 мкл промотора (со стадии а), лигируют и осаждают. ДНК суспендируют и режут при помощи ВатН1. ДНК получают очисткой в агаровом геле.

г)Лигирование фрагментов.

Готовый экспрессионный вектор получают лидированием фрагмента ВатНЧ (промотор и ген интерферона типа омега 1) с вектором рЮВ207.

д)Трансформация.

Клетки E.coli HB101 трансформирукгг путем добавления раствора лигированной ДНК и культивируют на LB-агаровых пластинках, содержащих 100 мкг/мл ампициллина. Выбирают 12 из полученных клонов и выделяют содержащиеся в них плазмиды. После анализа плазмид при помощи ре- стрикционного анализа и электрофореза в агаровом геле отбирают плазмиду, имеющую правильную конструкцию. Ее обозначают как pY-IDB-HulFN-омега 1.

П р и м е р Б. Конструкция экспрессион- ной плазмиды рРНЮО.

ДНК плазмиды pER103 расщепляют эн- донуклеазой Hindlll, б -концевые фосфатные остатки удаляют щелочной фосфатазой кишечника теленка (ФТК). ДНК осаждают дабавлением 0,1 об% раствора ЗМ ацетата натрия с рН 5,5 и этанола. Осадок ДНК центрифугируют и промывают 70%-ным раствором этанола.

Синтетические олигонуклеотиды o(AGCTTAAGATGAGCT) и о(САТСТТТА) фос- форилируют Т4-полинуклеотидкиназой (ПНК).

Раствор плазмиды и фосфорилованного олигонуклеотида перемешивают и нагревают до 70°С в течение 5 мин, затем охлаждают до 0°С и добавляют буфер лигирования (500 мМ трис, рН 7,5), 100 мМ хлорида магния, 200 мМ дитиотрейтола (ДТТ), 1 мМ у АТР, 500 мкг/мл альбумина сыворотки

72753326

крупного рогатого скота (АСС), Т4-ДНКлига- зу. Реакцию проводят при 4°С в течение 40 ч. Ее прекращают путем нагревания при 70°С в течение 10 мин.

Продукт лигирования переваривают эн- донуклеазой SaC1, затем лигируют и подвергают трансфекции в клетки E.coli HB101. Бактерии наносят на LB агаровые плитки, содержащие 50 мкл/мл ампициллина.

12 из бактериальных колоний произвольно выбирают, выделяют плазмиды и режут эндонуклеазой Sad.

Наличие линейной молекулы ДНК длиной 4400 п.о. подтверждает, что мес 5 то распознавания SaC1 было встроено в плазмиду. Одну из плазмид произвольно выбирают. Плазмиду, обозначенную как рРНЮО, расщепляют эндонуклеазами EcoR1 и ВатН1, разделяют в 1% агарового

20 геля и меньший фрагмент выделяют из геля. Этот EcoR1-BamH1 фрагмент ДНК длиной примерно 460 п.о. подвергают анализу.

ПримерВ. Конструкция плазмиды pANFc R-1.

25 дн К переваривают с помощью Hindlll в 50 мкл и затем с помощью EcoR1. Получают фрагмент EcoR1-Hindlll, содержащий область длиной 1 т.п.о. растворимого дДНК FcgR. Переваренную ДНК подвергают

30 электрофорезу в 1%-ном агаровом геле, выделяют Hindlll-EcoR1 фрагменты путем электроэлюации с последующим осаждением в 70%-ном этаноле. PGEM4 переварива- ютс помощью Hindlll и EcoR1, экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Фрагменты

35 лигируют и подвергают трансфекции в E.coli (МС1065). Один клон отбирают, размножают и обозначают как р ANFcf R-1.

П р и м е р Г. Конструкция плазмиды pANFc R-2.

40 pFcg R-1 переваривают рестриктазой EcoR1, подвергают электрофорезу в агаровом геле(1%). EcoR1 фрагмент длиной примерно 1,7 т.п.о. выделяют электроэлюацией с последующим осаждением этанолом при 45 80°С в течение 1 ч. Фрагмент переваривают рестриктазой Асс1 и частично рестриктазой SauSA с последующей экстракцией фенолом и осаждением этанолом с получением Sau3A-EcoR1 фрагмента. ДНК фрагмент

50 подвергают лигированию с синтетическим линкером (S -GATCTGAGTCATGGTACC- ATGACTCAGATCGTGCTG-3 ). ДНК экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Фрагменты растворяют, переваривают ре55 стриктазой Крп1 и экстрагируют фенолом с последующим осаждением этанолом. Избыточный линкер удаляют хроматографией в геле (биогел А 50 м). pGEM 4 переваривают

27

рестриктазой Крп1, затем EcoRL Фрагменты, связанные с синтетическими линкерами, подвергают лигированию с Крп1 и EcoR1 фрагментом pGEM4 и осуществляют транс- фекциювЕ.со11(МС1065). &ioHpANFcf R-2, у которого отсутствует только цитоплаз- менный домен, выделяют и размножают с использованием известного метода гибридизации колоний. П р и м е р 1.

а)Выделение сырого Fc R из культу - ральной нэдосадочной жидкости.

Клетки RPM1-8866 культивируют в среде RPM1-1640, содержащей еще 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, при плотности 1x10° клеток/мл и жизнеспособности клеток 95-99%. Клетки собирают, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15 мин, промывают три раза раствором Хен- ка ББС и культивируют в бессывороточной среде в течение 48 ч при той же плотности. Культуральную надосадочную жидкость собирают и добавляют 1 мМ фенилметилсуль- фонилфторида (ФМСФ), 0,02% азида натрия и 200 ед/мл апротеина. Культураль- ныенадосадочные жидкости хранят при 4°С во время концентрирования, которое осуществляют фильтрацией. Затем концентри- рованный в 200-300 раз материал центрифугируют с тем, чтобы удалить нерастворимый материал. Получают при этом сырой FcЈ R.

б)Выделение FC R из клеточных лиза- тов.

Клетки RPM1-8866 (2х109 клеток) промывают четыре раза буфером РВС (содержит 0,5% поверхностно-активного вещества НП-40) и лизируют в 10 мл буфера лизиса и 1 мМ ФМСФ в течение 45 мин во льду при периодическом перемешивании. Дополнительно добавляют еще 10 мл буфера лизиса и реакцию продолжают во льду в течение 30 мин. Лизат центрифугируют пр 37000 об/мин в течение 45 мин при 4°С. Липидный слой тщательно собирают, надосадочную жидкость собирают и хранят при -70°С.

П р и м е р 2. Иммуноочистка.

Концентрат культуральной надосадочной жидкости (см. пример 1а), эквивалентный 5- 10л культуры, подвергают последовательной адсорбции на 2 мл сефарозного геля, связанного с альбумином сыворотки крупного рогатого скота, связанного с человеческим трансферрином сефарозного геля и связанного с мышиным иммуноглобулином сефарозного геля, каждый раз в течение 1 ч при 4°С. Вытекающий поток, собираемый с последнего геля, затем подают на 2 мл анти

1727533

28

5

5

0

5

0

S

0

5

Fcf R (3-5), связанного с сефарозой. Им муноадсорбцию проводят в течение 4-16 ч при 4°С. Гель подают в колонку, вытекающий поток собирают и гель последовательно промывают 150 мл буфера А (10 мМ трис-HCI, рН 7,5, 0,5 М хлорида натрия, 0,5% НП-40), 150 мл буфера Б (10 мМ трис- HCI, рН 7,5, 0,1% НП-40), 150 мл буфера В (ЮмМ трис-HCI, рН 7,5), элюируют25мл 2,5 об.% уксусной кислоты и сразу же нейтрализуют в 2 М трис-HCI с рН 8,0. Полученный материал хранят при -80°С, если он не подвергается непосредственной очистке путем жидкостной хроматографии. Затем элюат фракционируют путем жидкостной хроматографии с обращенной фазой на колонке С4 с использованием линейного градиента 0-65% ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты.

П р и м е р 3. Анализ с использованием связанного с энзимом иммуносорбента (метод эним).

Активность FcgR измеряют за счет определения его способности к связыванию с моноклональными антителами 3-5 и 8-30. На микротитровальные пластинки сначала наносят 100 мкл на пробу моноклонального антителя 3-5 (в бикарбонатном буфере) 0,1 М бикарбоната натрия, рН 9,6, после чего инкубируют в течение ночи при 4°С, промывают четыре раза фосфатным буфером, содержащим 0,05% твина 20, с последующим добавлением 100 мкл исследуемого образца, разбавленного буфером с рН 8,1 (0,05 М трис-HCI, 1 мМ хлорида магния, 0,15 М хлорида натрия, 0,05 об. % твин 20,0,02 % азида натрия и 1 % АСС). Микротитровальные платы инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч и промывают. Добавляют 100 мкл предварительно титрованного и разбавленного конъюгата из козьего -анати-мыши- ного иммуноглобулина М и щелочной фосфатазы. Платы инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч и промывают, добавляют 100 мкл субстратного буфера (0,05 М бикарбоната натрия, рН 9,8, 10 мМ гексагидрата хлорида магния), содержащего 1 мг/мл n-фенилфосфата динатрия, и ко- лориметрируют каждые 30 мин в течение 2 ч при 405 и 620 нм.

П р и м е р 4. Гидролиз рецептора при помощи лизилендопептидазы и отделение пептидов.

Очищенный FcЈ R переваривают с помощью лизилендопептидазы Achromobacter lyticus в 50 мМ буфера трис-HCI с рН 9,5 при получают путем хроматографии на олиго- dT-целлюлозе. Радиомаркированную дДНК синтезируют из поли/А/+-РНК с использованием P-dCTT. Маркированную дДНК

35°С в течение 6 ч при весовом соотношении энзима к субстрату, равном 1:500. Лио- филизованные пептидные фрагменты, очищают жидкостной хроматографией.

Отделение пептидов жидкостной хроматографией с обращенной фазой.

Отделение пептидов осуществляют посредством жидкостной хроматографии на колонке С4. Элюацию пептидов осуществляют с соблюдением следующих условий: линейный градиент смеси 2-пропанола и ацетонитрила в объемном соотношении 7:3 в пределах от 0 до 35% в течение 1 ч в 0,1 % трифторуксусной кислоты, расход 1-,0

Met-Glu-Leu-Gin-Val-Ser-Ser-Gly-Phe-Val-,

Gly-Glu-Phe-Ile-Trp-Val-Asp-Gly-Ser-His-Val-Asp-Tyr-Ser-Asn- Trp-Ala-Pro-Gly-Glu-Pro-Thr-,

Lys-His-Ala-Ser-Hi s-Thr-Gly-Ser-Trp-Ile-Gly-Leu-Arg-Asn-Leu- Asp-Leu-LysLys-Trp-Ile-Asn-Phe-Gln-.

П p и м е р 5. Получение олигонуклеоти- ца формулы

З -ТТ АСС TAG TTЈ AA GT -5 А

Олигонуклеотид синтезируют с использованием синтезатора А 1, деметилируют смесью тиофенола, триэтиламина и диокса- на в соотношении 1:2:2 при комнатной температуре в течение 90 мин и промывают метанолом (10x1 мл метанола). После очистки деметилированного олигонуклеотида на пористом стекле и снятия защитной группы концентрированным аммиаком при комнатной температуры в течение 1 ч и при темпе- ратуре 55°С в течение 16 ч осуществляют сушку продукта.

Дальнейшую очистку осуществляют с 20% акриламидным гелем в присутствии 8 М мочевины, с элюацией ТБЕ-буфером (10,9 г три(оксиметил)аминометана, 5,5 г борной кислоты и 9,3 г динатриевой соли этиленди- нитрило-тетрауксусной кислоты в 1 л).

Электрофорез проводят в геле (40x25x0,01 см) при 50 Вт. Полосу 17-мер вырезают, элюируют водой и обессоливают на колонке с сефадексом С 25 с водой. Фракции, содержащие 17-мер, собирают и

0

5

мл/мин. Фракционированные пептиды собирают путем определения абсорбции при 215 нм.

Определение аминокислотных остатков и их последовательности.

Анализы проводят после осуществления гидролиза пептидных фрагментов в 5,7 HCI при 110°С в течение 22-24 ч в эвакуированных закрытых трубках. Аминокислоты фенилтиогидантоина {ФТГ) определяют жидкостной хроматографией с обращенной фазой. Определяют следующие аминокислотные последовательности:

30

сушат. Выход: 285 мкг (оптическая плотность 260:7,7).

П р и м е р 6. Установление L-клеточных

трансформантов

Один миллион клеток LtK подвергают трансфекции 150 нгвируса Герпес симплекс из tK гена и 20 мкг высокомолекулярной геномной ДНК из клеток RPM1-8866. После

хранения в HAT среде в течение 10 дней отбирают клетки. Клетки I, которые проявляют устойчивость к HAT, собирают, травят биотинированным анти-Рс,.Р(8-30)иавиди- ном, связанным с изотиоцианатом флуоресцеина(ИТСФ), и классифицируют, проводят несколько циклов классификации для каждой трансфекции. В независимых трансфек- циях получают две трансформантные линии: L-V-80-30 и L-V1-8-30.

Пример. Клонирование дЦНК Fc, R

Проба 1.

РНК выделяют из трансформанта L-V-8- 30 известным методом с использованием гуанидина и хлорида1 цезия. Поли/А/ -РНК

31

подвергают ренатурации избыточной поли/А/ -РНК нетрансформированных LtK клеток и подают на оксиапатит колонку. Од- нонитевую с дДНК собирают и используют в качестве пробы 1.

Проба 2.

Олигонуклеотиды 17-мер, дополнительные к мРНК последовательности, кодирующей аминокислотный фрагмент Lys-Trp-lfe-Asn-Phe-GIn, и содержащие смесь 24 возможных последовательностей, радиомаркируют х 32Р-АТР при помощи Т4-полинуклеотид-киназы. Двухнитевую дДНК синтезируют из поли/А/+-РНК, полученной из клеток RPM1-8866. После обработки метилазой EcoR1 и полимеразой ДНК Т4 двухнитевую дДНК длиной более 1000 п.о. клонируют в EcoR1 место лямбда gt10 с использованием EcoRI-линкеров. Приготовляют два набора реплика-фильтров из фага. Один набор фильтров подвергают гибридизации с Р-маркированными олиго- нуклеотидами 17-мер (проба 2). Другой набор фильтров подвергают гибридизации с 32Р-маркированной дДНК, специфичной относительно FcfR положительных клеток L (проба 1), при 68°С в течение ночи в 6xSSC(1xSSC:0,15 M хлорида натрия, 0,015 М цитрата тринатрия, рН 7,0), после чего промывают 0,1xSSC и 0,1% додецилсульфа- та натрия. Пятна, которые гибридизируют с обеими пробами, выделяют.

ПримерЗ. Экспрессия дДНК FcfR.

Для экспрессии дДНК в pGEM4 с использованием промотора SP6 мРНК синтезируют с помощью SP6 РНК полимеразы с использованием в качестве матрицы переваренного ВатН1 рРс R-1. 10 нг мРНК впрыскивают в один ооцит, в качестве контрольного опыта аналогично получают мышиную BSF-1 мРНК, которую впрыскивают в другой ооцит. После инкубации в течение 2 дней в среде Барта при 20°С ооциты подвергают лизису в 50 мкл буфера лизиса (10 м.М трис-HCfc рН 7,5,0,5 М хлорида натрия, 0,5% НП-40). Лизаты ооцитов исследуют на активность Fc R с использованием метода эним, в котором используют два анти-РсЈ R антитела (3-5 и 8-30). В качестве контрольного опыта используют концентрированную надосадочную жидкость, полученную из клеток RPM1-8866.

Для экспрессии дДНК Fcg R в клетках Cos-7 вставку pFc R-1 клонируют в EcoR1 место вектора pDE2. 5x10 клеток Cos-7 наносят на 60 мм плитки за день до трансфек- ции,которую проводят с использованием 2 мкг плазмидной ДНК в 1 мл буфера, состоящего из 25 мМ трис-HCf (рН 7,5), 137 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида калия, 0,6 мМ

10

72753332

гидрогенфосфата натрия, 0,5 мМ хлорида магния и 0,7 мМ хлорида кальция, и 500 мкг декстрана, снабженного диэтиламиноэ- тильными группами. После часовой инкубации при 37°С раствор заменяют ДМЭМ, содержащего 10% FCS и 150 мМ хлорокви- на, инкубируют при 37°С в течение 3 ч и затем заменяют свежим ДМЭМ, содержащим 10% FCS. Через 48 ч клетки обрабатывают связанным с фикоцианином анти-Fc.R антителом (3-5) и биотинированным иммуноглобулином Е, проявляют при помощи ИТСФ-авидина и подвергают анализу.

П р и м е р 9. Определение нуклеотидной f 5 последовательности дДН К Fc,- R.

Вставку рРсЈ R-1 переваривают энзимами Hindlll и Pvull. ДНК субклонируют в М13 и подвергают анализу.

20 I

Примерю. Анализ мРНК Рсг R.

Поли/А/+-РНК из различных клеток разделяют в агаровом геле (1 %), подают на нит- роцеллюлозную бугаму и гибридизуют со вставкой pFc-R-1, меченной в ник-трансля25 ции. Для индукции BSF-1, 100 миллионов клеток В или Т культивируют в отсутствии или в присутствии 10 мкг/мл иммуноглобулина Е и 50 мкг/мл рекомбинантного человеческого BSF-1 10 мкг всей РНК

30 экстрагируют и анализируют.

ПримерП. Экспрессия водорастворимой части человеческого рецептора Fc,. малого сродства в дрожжах.

Стадия 1. Получение плазмид PjDB-244 и pjDB-245.

а) Получение плазмиды pRH 241, содержащей дрожжевой ADH1 терминатор.

35

Получение вектора.

10 мкг Bluescribe M13+ подвергают двойному перевариванию с 20 единицами Sail и 20 единицами Sphl. Реакцию прекращают путем добавления 1/25 обьема 0,5 М

динатриевой соли этилендинитрилотетра- уксусной кислоты и нагревания при 7°С в течение 10 мин. Разрезанный вектор очищает путем электрофореза на агаровом геле (1% агарозы, 1хТВЕ-буфер, состоящий из

6,05 г/л трис-оксиметиламинометана, 3,1 г/л борной кислоты, 0,37 г/л ЭДТА и содержащий 0,5 мкг/мл бромида этидия при 4 в/см). После обнаружения полосы ДНК с использованием ультрафиолетового света (254 нм) ДНК выделяют электроэлюацией с

использованием бумаги ДЕ81 и очищают осаждением этанолом. ДНК растворяют в 10 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА).

33

Получение вставки.

10 мкг pWS214 4 переваривают 20 единицами Sphl и 20 единицами Sail Меньший фрагмент, содержащий ADH1 -терминатор, выделяют путем электрофореза в агаровом геле, электроэлюации и осаждения. Полученную ДНК растворяют в 10 мкл ТЕ-буфе- ра. 1 мкл векторной ДНК и 1 мкл вставки ДНКлигируютТУ-ДНКлигазой в 10 мкл раствора. 3 мкл лигазной смеси используют для трансформации E.coli IM101 SupE, thi, del/lac-proAB/, F traD36, proAB, tectg, lacZ -del M15, лямбда-минус). После селекции ампициллином плазмиды выделяют и переваривают с помощью Sphl и Sa(l. Фрагменты разделяют в агаровом геле. Одну из плазмид отбирают и обозначают как pRH 241.

б) Получение плазмиды pRH 242, содержащей дрожжевой ADH1-промотор и дрожжевой ADHI-терминатор.

Получение вектора.

Плазмиду pRH 241 подвергают двойному перевариванию с помощью EcoR1 и Крп1. Меньший фрагмент удаляют из векторной части путем электрофореза в агаровом геле, электроэлюации и осаждения. Полученный фрагмент растворяют в ТЕ-буфере.

Получение вставки.

Плазмиды pV-jDB-Hu-jFN-омега 1 (см. пример А) разрезают рестриктазой SphT. S - конец удаляют ДНК полимеразой 1 E.coli в присутствии dGTP. ДНК гидролизуют Xho1, фрагменты выделяют путем электрофореза в агаровом геле, электроэлюации и осаждения. Тупой конец фрагмента длиной 400 п.о.,

Название

MF 1 TCGAGCCTCATATCAATGAGATTCCCATCTATTTTCACTGCTGTTTTGTT

(50-мер)

MF 2 AGCAGCGAACAAAACAGCAGTGAAAATAGATGGGAATCTCATTGATATGA GGC (53-мер)

MF 3 CGCTGCTTCCTCCGCTTTGGCTGCTCCAGTCAACACTACTACTGAAGACG AAACTGCTCAAATTCCAGCT (70-мер)

MF 4 CAGCTTCAGCTGGAATTTGAGCAGTTTCGTCTTCAGTAGTAGTGTTGACT GGAGCAGCCAAAGCGGAGGA (70-мер)

MF 5 GAAGCTGTCATCGGTTACTCTGACTTGGAAGGTGACTTCGACGTTGCT (48-«ер).

1727533

34

5

5

0

5

содержащий ADH1-промотор, подвергают лигированию с адапторной парой ЕВ1-410: 5 ATTGGAAGGATC 3 ЕВ 1-429: 3 CCTTCCTAG-P5 .

Липкий конец фрагмента видоизменяют с использованием адапторной пары ЕВ1-418: 5 p-TCGAGCACGTGGTAC 3 ЕВ1-424:CGTGCAC51

После одновременного лигирования обоих адаптеров фрагмент, содержащий ADH1-промотор, очищают электрофорезом в агаровом геле.

Вектор и вставки лигируют, в результате лигирования вставки в вектор места EcoR1 и Крп1 разрушаются. Лигазной смесью трансформируют E.coli IM101. Колонии исследуют на присутствие плазмиды с желаемой конструкцией. Одну плазмиду отбирают и обозначают pRH,242.

в) Получение плазмиды pRH 243, содержащей дрожжевой ADHI-npoMOTOp, ген, кодирующий доминантный пептид дрожжевого фактора MFa, мультиклонирующее место и дрожжевой АОН1-терминатор.

Ген доминантного пептида MF «синтезируют химическим путем с использованием дрожжевого кодона.

Получение вектора.

Плазмиду pRH 242 переваривают с помощью Xhol и ХЬа1. Фрагмент очищают электрофорезом в агаровом геле, электро- элюацией и осаждением.

Получение вставки.

Получают следующие олигодеоксинук- леотиды:

I

Последовательность

MF 6 GCAAAACAGCAACGTCGAAGTCACCTTCCAAGTCAGAGTAACCGATGA (48-мер)

MF 7 GTTTTGCCATTCTCCAACTCCACTAACAACGGTTTGTTGTTCATTAAC ACTACTATTGCATCGATTGCT ()

MF 8 CCTTAGCAGCAATCGATGCAATAGTAGTGTTAATGAACAACAAACCGTTG

TTAGTGGAGTTGGAGAATG (69-uep)

MF 9 GCTAAGGAAGAAGGTGTTTCTTTGGACAAGAGGCCTCTGCAGGAATTCT (49-иет))

MF 10 CTAGAGAATTCCTGCAGAGGGCTCTTGTCCAAAGAAACACCTTCTT

(46-iiep)

60 пмоль каждого олигонуклеотида, за исключением MF 1 и MF 10, фосфорилируют с использованием Т4-полинуклеотидуиназы (ПНК). 60 пмоль MF 1 и MF 2 объединяют. Объединяют также растворы MF 3 и MF 4, MF 5 и MF 6, MF 7 и MF 8, MF 9 и MF 10. Объединенные растворы нагревают при 100°С и медленно охлаждают до комнатной температуры. Затем все растворы объединяют, добавляют 20ед. Т4-лигазы и реакцию лигирования проводят при 14°С в течение 16ч.

0.5 мкл векторной ДНК и 7 мкл раствора смеси лигирования объединяют и подвергают лигированию с использованием 5 ед. Т4-лигазы. E.coli IM101 трансформируется лигазной смесью. Из некоторых колоний выделяют плазмиды, анализируют их

ЕВ -491: V ТС0А0СТСАТАТАСМТ60- АТС GAA ТТС СМСТТ ТСС ТОТ

СОТ ТТС &ТТ TGT ЛАС ACT TG-T CCA GAAАЛС TGЕШ -95: 3 С АОТЛТАТ&ТТЛСС TAG G-TT ААС СТТ САААСС АСА ССА

ЛАО САЛ АСА TTG TG-A АСА &Л1 СТТ ТТСАСС TAGс тем, чтобы восстановить полный ген с использованием дрожжевого кодона формулы

155160165

Glu Leu Gin Val Ser Ser Gly Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu GAA TTG CAA-GTT TCC TCT GGT TTC GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA CTT AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG САА АСА TTG TGA АСА GGT CTT

с помощью Xho1 и ХЬа1. Плазмиды, содержащие вставку размера 290 и.о., подвергают дальнейшей характеристике путем клонирования вставки в МТЗмрЗ с последующим анализом с использованием метода Сангера. Плазмиду, содержащую ожидаемую вставку, обозначают как pRH 243.

г) Получение плазмиды pRH 244, содержащей ADHI-промотор, последовательность, кодирующую водорастворимый фрагмент Fc R и АОШ-терминатор.

Получение вставки.

Плазмиду pGEM4, содержащую больший Hindlll/EcoR1 фрагмент дДНК , разрезают рестриктазами EcoR1 и Hindlll и обрабатывают фрагментом Кленова, дефос- форилируют, очищают и разделяют на агаровом геле. Синтезируют два линкерных олигонуклеотида формул

$см/ЗЖ-) Jtei5 TCGAGCTCATATACA АТС

3 CGAGTATATGT ТАС

XhoI

Trp TG ЛСС TAG Sau3A

3

5

25 пмоль каждого олигонуклеотида pe- натурируют и добавляют примерно к 3 мкг фрагмента SauSA (5 -фосфат/ЕсоР1 /встроенного, дефосфорилиро ванного) и лигируют с использованием Т4-ДНК лигазы. Получаемый фрагмент Xho1-/EcoR1/ очищают путем электрофореза в агаровом геле.

Получение вектора.

Плазмиду pRH 242 разрезают эндонук- леазой ХЬа1, концы затупляют за фрагментом Кленова. ДНК разрезают Xho1 и больший фрагмент выделяют электрофорезом в агаровом геле.

Вектор и вставку лигируют (лигирова- ние встроенного EcoRI места на встроенное ХЬа1 место приводит к восстановлению как места EcoRI, так и места ХЬа1). Лигазную смесь используют для трансформации E.coll IM101. Из колоний выделяют плазмиды, которые исследуют на присутствие гена водоGlu Leu Gin Val Ser Ser Gly Phe Val Cys Asn Thr Cys Pro Glu GAA TTG CAA GTT TCC TCT GGT TTC GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA CTT AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG CAA АСА TTG TGA 4 JA GGT CTT

Trp TG ACC TAG Sau3A

3

5

синтезируют два олигонуклеотида формулы

EBI-430:

5 ATGGAATTGCAAGTTTCCTCTGGTTTC ATG GAA TTG CAA GTT TCC TCT GGT TTC GTT TGT AAC ACT TGT CCA GAA AAG TG

EBI-437:

3 TACCTTAACGTTCAAAGGAGACCAAAG TAG CTT AAC GTT CAA AGG AGA CCA AAG CAA АСА TTG TGA АСА GGT CTT TTC .ACC TAG 5

Sau3A

растворимого фрагмента с использованием некоторых рестрикционных энзимов. Одну из плазмид отбирают и фрагмент Xho1- Xba1 подвергают анализу последовательностей с тем, чтобы подтвердить правильную связь между ADHI-промотором и человеческим геном. Эту плазмиду обозначают как pRH244.

д) Получение плазмиды pRH 245, содержащей дрожжевой АОН1-промотор, доминантный ген дрожжевого фактора MFa , ген водорастворимого фрагмента Fc R и дрожжевой АОН1-терминатор.

Получение вектора.

Плазмиду pRH 243 подвергают перевариванию с помощью EcoR1 и Stu1. Больший фрагмент очищает электрофорезом в агаровом геле, электроэлюацией и осаждением.

Получение вставки.

Плазмиду pGEM4/FcЈ R/ подвергают двойному перевариванию с помощью EcoR1 и Hindlll с последующим дефосфорилирова- нием. Вставку гидролизируют рестриктазой SauSA и больший фрагмент выделяют. С целью восстановления полной области, кодирующей растворимый фрагмент формулы

Met

5f ATG 3 ТАС

0

5

0

5

25 пмолей каждого олигодеоксинуклео- тида подвергают ренатурации и добавляют к 3 мкг фрагмента Sau3A-EcoR1. Реакцию лигирования проводят в растворе общего объема 20 мкл с использованием Т4-ДНК лигазы. Получаемую ДНК очищают путем электрофореза в агаровом геле, электро- элюации и осаждения.

1 мкл векторного фрагмента и 1 мкл фрагмента вставки лигируют. Лигазную смесь используют для трансформации E.coli IM101. Из некоторых колоний выделяют плазмиды, которые исследуют на присутствие гена водорастворимого фрагмента FccR с использованием нескольких рестрикцио1н- ных энзимов. Одну из плазмид отбирают и фрагмент Cta1-Xba1 подвергают анализу последовательностей с тем,чтобы подтвердить правильную связь между участком фактора MFa и геном водорастворимого фрагмента Fc.R. Эту плазмиду обозначают pRH 245.

е) Получение дрожжевых векторов.

Плазмиды pRH 244 и pRH 245 конструируют с использованием вектора из E.coli (Btuescribe), который облегчает анализ вставок. Обе плазмиды разрезают с помощью Hindlll и ВатН1 и лигируют в дрожжевой вектор pjDB207, содержащий 2ц начало репликации и leu 2 избирательный маркер.

Получение вектора.

Плазмиду plDB207 подвергают двойному перевариванию с помощью Hindlll и ВатН1, Большой фрагмент выделяют путем электрофореза в агаровом геле, электро- элюации и осаждения.

Получение вставки.

Плазмид pRH 244 и pRH 245 подвергают двойному перевариванию с помощью Hindlll и ВатН1.

Вектор и вставки лигируют в растворе и трансформируют E.coli IM101. ДНК полученных колоний исследуют на правильность конструкции, Отбирают две плазмиды, одну из которых обозначают рЮВ-244 (содержащую экспрессионную

EBi-4%:

к

&/iACTGCAG I&AGGTCTSaTrrTGGril1GCAACACTlieCGC&GA,uiAAT& 3:

Ш-;1-97:

CITGAC&TGGAClUaAGAGGAAAGCAAAG&TTST&AACGGGGCTTTTTACGTASкоторые восстанавливают считывающий скелет, начиная с второго кодона (Gfu) гена растворимого фрагмента FcgR ренатурирукассету без доминантной последовательности MF а), а другую - как рЮВ-245 (содержащую экспрессионную кассету с доминантной последовательностью MFa).

Обе плазмиды выделяют и используют для трансформации дрожжевого штамма WS21-3(a, Ien2, his3, игаЗ, рер4).

Стадия 2. Получение плазмид 289а1 и 289ЬЗ.

Плазмиду YEpG переваривают рестриктазами Hindlll и BamHl. Линеаризованный вектор выделяют электрофорезом в агаровом геле. По 1 мкг каждой плазмиды pRH244 и pRH245 переваривают с помощью Hindlll

и BamHl. Из рРН244 выделяют фрагмент длиной 1650 п.о., а из pRH245 - фрагмент длиной 1900 п.о. 50 нг линеаризованногс вектора и 200 нг фрагментов лигируют и используют для трансформации E.coli

НВ101. Отбирают штаммы, устойчивые к ампициллину.

Плазмиды колоний исследуют на правильность конструкции при помощи ре- стрикционных энзимов. Получают две

плазмиды, которые обозначают 289а1 (из PRH244) и 289ЬЗ (из pRH245).

Пример12. Экспрессия растворимогс фрагмента в E.coli. Получение вектора.

Плазмиду pRH 100 (см, пример Б) переваривают с помощью Ssf1, 3 -концы удаляют ДНК полимеразой 1. Линеаризованную плазмиду дефосфорилируют. Получение вставки.

20 мкг pGEM4-FcgR, содержащего больший Hindlll-EcoR1 фрагмент дДНК для FccR подвергают двойному перевариванию с помощью EcoR1 и Hindlll. 5-концы затупляют фрагментом Кленова ДНКполимеразы 1. 5 фосфатные группы удаляют с использованием фосфатаза кишечника теленка. После очистки в агаровом геле фрагмент, содержащий ген растворимого фрагмента , гид- ролизуют рестриктазой ЗаиЗА и больший

фрагмент выделяют.

50 пмоль каждого олигонуклеотида

С 1

S&c/Jrf

ют и медленно охлаждают. Олигонуклеоти- ды и вставку ДНК лигируют с помощыс Т4-ДНК лигазы.

1 мкл линеаризованной векторной ДНК и 5 мкл ДНК вставки объединяют и лигиру- ют. Половину материала используют для трансформации E.coli HB101 (Г, hsdS20 /rb-, mb/, rec A13, ara-14, proA2, -fecYI, gat K2, rpsL20 /Зм-устойчиво/, xyt-5, mtf-1, SupE44, лямбда минус). Плазмиды устойчивых к ампициллину колоний выделяют и исследуют на правильность конструкции при помощи рестрикционных энзимов. Одну плазмиду отбирают и подвергают анализу соединения между Trp-промотором и геном растворимого фрагмента FcЈR. После этого заключительного анализа плазмиду обозначают как pRH 246.

П р и м е р 13. Конструкция плазмиды pSFcЈR-1.

а)350 мкг pbSF2-38, который содержит дДНК для BSF-2 в Sma1 вместе pGEM4, переваривают 700 единицами EcoR1 и ВатН 1 в 500 мкл буфера (100 мМ хлористого натрия, 50 мМ трис-HCt, рН 7,5, 10 мМ хлорида магния, 1 мМ ДТТ) при температуре 37°С в течение 2 ч. Переваренную ДНК подвергают очистке путем электрофореза в 1 %- ном агаровом геле. Выделяют EcoRI-BamHI-фрагмент, содержащий дДНК для BSF-2 длиной 1,2 т.п.о. 20 мкг этого фрагмента гидролизуют единицами Hinfl. Экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Фрагмент с тупым концом и длиной 127 п.о. экстрагируют фенолом, переваривают 40 единицами Kpnl, инкубируют 2,5 ед. бактериальной щелочной фосфатазы, после чего подвергают электрофорезу в агаровом геле (1%). Полученный фрагмент длиной 110 п.о., содержащий доминантную последовательность BSF-2, подвергают электро- элюации и осаждению этанолом. Фрагмент длиной 110 п.о. лигируют с переваренной Крп1 и Sma1 плазмидой pGEM4 и трансфи- цируют в E.coli (MC1065). Из полученных колоний отбирают клон, содержащий только одну доимнентную последовательность, его обозначают pBSF2-L8.

б)Плазмиды LE-392 или pGEM4 (pFc R-1) переваривают 150 единицами Н ind 111 и подвергают электрофорезу в агаровом геле (1%). Фрагмент Hindlll, содержащий растворимый участок FcЈ R, электроэлюируют из геля, осаждают этанолом и растворяют. Фрагмент Hindlll инкубируют при 20°С в течение 30 мин в присутствии 8,2 ед. фрагмента Кленова и 1 мМ dNTP в среде 10 мкл 1 х буфера ник- трансляции с тем, чтобы заполнить 3 -концы, экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Фрагменты Hindlll с заполненными З -концами гидролизуют рестриктазой

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

Psfl ифосфорируют. pBsF2-L8 гидролизуют рестриктазой ВатН1. экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Затем растворяют, переваривают нуклеазой Pstl, экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Переваренный Pstl фрагмент, содержащий кодирующий FcЈ R растворимый участок, и переваренный Pstl фрагмент pBsF2-L8 лигируют и используют для транс- фекции E.coli (MC1065). Отбирают клон, обозначают psFc R-1. Размноженная плаз- мида содержит семь оснований от многократного клонирования в рСЕМ4 между доминантной последовательностью BSF- 2 и последовательностью Fc R.

П р и м е р 14. Экспрессия дДНК для Fc,R.

Плазмиду psFc4R-1, содержащую модифицированную дДНК для FcЈR, переваривают рестрикционным энзимом ВятН1. мРНК синтезируют при помощи SH6 РНК полиме- разы с использованием в качестве матрицы линеаризованной плазмидной ДНК. Примерно 9 нг мРНК впрыскивают в ооциты Xenopus leavis, которые инкубируют при 20°С в модицированной среде Барта, содержащей 100 мкг/мл пенициллина и 1 мкг/м/ стрептомицина. После двухдневной инкубации надосадочную жидкость собирают и ооциты подвергают гомогенизации в среде буфера PBS, содержащего 1 мМ ФМСФ. Литазы PBS разделяют путем центрифугирования при 15000 об/мин в течение 10 мин. Центрифугат снова экстрагируют НП-40 со- любилизации связанного с мембраной рецептора (0,5% НП-40,0,1 М хлорида натрия, 0,05 М трис-HOf, рН 7,5).

П р и м е р 15. Анализ FcЈR в ооцитах с использованием дрдецилсульфата натрия и полиакриламидного геля.

10 ооцитов, в которые была введена мРНК, инкубируют при температуре 20°С в течение 24 ч в 100 мкл модифицированной среды Барта, содержащей 150 микС 353-ме- тионина. Маркированные ооциты лизируют в 1 мл буфера лизиса (0,5% НП-40, 0,1 М хлорида натрия, 0,05 М трис-HCf, рН 7,5) и центрифугируют при 15000 об/мин в течение 10 мин. Осветленные лизаты и надосадочную жидкость подвергают очистке на шариках сефарозы 4В со связанным мышиным иммуноглобулином, с последующей инкубацией в присутствии шариков сефарозы 4В, с которыми связано антитело 3/5, с которым связан иммуноглобулин G1. Инкубацию проводят во льду при частом встряхивании. Шарики промывают, продукты элюируют содержащим додецилсульфат натрия буфером путем кипячения в течение

2 мин. Образцы подвергают анализу с использованием додецилсульфата натрия и полиакриламидного геля (9%).

Пример 6. Определение .

Активность Fc R определяют методом эним, для чего используют два различных моноклинальных анти-Fc R антитела (3-5; с иммуноглобулином 1; 8-30; с мышиным иммуноглобулином), которые вступают в реакцию с двумя различными эпитопами на с последующим добавлением 100 мкл образцов, разбавленных буфером (0,05 М трис-HCf, рН 8,1, 1 мМ хлорида магния, 0,15 М хлорида натрия, 0,05% твина, 20,1 % альбумина сыворотки крупного рогатого скота и 0,02% азида натрия). Пластинки инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч, промываютчетыре раза промывным буфером, после чего добавляют 100 мл антитела 8-248, с которым связана щелочная фосфа- таза (0,75 мг/мл). После 4-часовой инкубации пластинки промывают 4 раза. Энзиматиче- скую реакцию инициируют добавлением п- нитрофенилфосфата в субстратном буфере.

Пример17. Определение связывания FcЈR с иммуноглобулином Е.

Плашеты, снабженные покрытием из антитела 3-5, инкубируют вместе с образцом в течение 2 ч, промывают, добавляют человеческие моноклональные иммуноглобулины (PS миелома). После двухчасовой инкубации при комнатной температуре пластинки промывают и инкубируют со щелочной фос- фатазой, связанной с моноклональным античеловеческим иммуноглобулином, проявляют добавлением n-нитрофенилфосфата в субстатном буфере.

Пример 18. Образование розетки иммуноглобулина Е.

Fc, R на лимфоцитах определяют путем анализа с использованием зафиксированных от RBC, снабженных покрытием из человеческого иммуноглобулина. Число розеток образующих клеток определяют после вычета числа неспецифического связывания с зафиксированными ox RBC, покрытыми альбумином сыворотки крупного рогатого скота. С целью торможения розетки иммуноглобулина Е 25 мкл несущих клеток (5хЮ°/мл) смешивают со специфическим объемом (например, 100 мкл) исследуемого образца или контрольной среды и инкубатируют при 4°Стечение 1 ч. Вычисляют число розеток с 3 или больше зафиксиро- ванными ox RBC. В первом и третьем опытах в качестве несущих клеток используют клетки RPM1-8866, а во втором опыте - клетки SKW6-C4. В качестве контрольной среды используют надосадочную

жидкость контрольных ооцитов, т.е. нетрансформированных ооцитов.

Анализ с использованием додецилсульфата натрия и полиакриламидного геля (а) 5 показывает, что продукт psFcЈR-1 из ооцитов, который распознается обоими антителами 3-5 и 8-30 и имеет связывающую иммуноглобулин активность с получением широких протеиновых полос и продукт IQ pANFc -R-1 из ооцитов, который не имеет N-концевого трансмембранного участка и может распознаваться антителом 3-5, но не антителом 8-30 (б) и который не проявляет связывающей иммуноглобулин Е активно- чс сти. Эти результаты свидетельствуют о том, что продукт р Д , который не имеет сигнальной последовательности, не перерабатывается нужным образом и что подходящая обработка, как в клоне psFcg R-1,

2Q создает эпитоп, который распознается антителом 8-30 и имеет связывающую иммуноглобулин активность.

Экспрессию водорастворимой части рецептора Fc-R проводят путем культивирова25 ния соответствующего штамма E.coli, дрожжей или клеток другого организма в общепринятых условиях с последующим концентрированием и очисткой полученного водорастворимого фрагмента.

оДрожжевой штамм WS21-1, трансформированный плазмидой 289ЬЗ (WS21- 1 /289е), культивируют в течение 40 ч в среде УН К8 до оптической плотности (546 нм), равной примерно 45 (вес сухих клеток 13 г/л).

5После отделения клеток путем центрифугирования выход FcЈ R составляет 2,5 ед/мл FcЈ R (1 ед/мл Fcf R соответствует активности надосадочной жидкости, равной 1х105 клеток RPMI/мл).

0

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ получения водорастворимой части человеческого рецептора малого сродства Fc,, заключающийся в том, что выделяс- ют водорастворимую часть связывающего иммуноглобулин Е-фактора FctR из лимфоб- ластоидных клеток RPM1 8866, очищают ее хроматографией, подвергают гидролизу, затем выделяют фрагменты, определяют в них

Q аминокислотную последовательность, на основании которой синтезируют олигонукТ А А

леотид 3 -ТТсТАСС ТА G TT G AA GT-5 ,

A G &

параллельно из клеток RPM1-8866 выделя- 5 ют поли(А)+-РН К, синтезируют дДНК длиной более 1000 Ьр, которую клонируют в EcoR1 сайт-ламбда gt10, далее осуществляют гибридизацию дДНК Fc,rR+L с синтезированным олигонуклеотидом, отбирают вставку

45

дДН К длиной 1600kb, которую клонируют в EcoR1 сайт-плазмиды LE392 или pGEM4, гидролизуют полученную ДНУ эндонуклеа- зой Pstlll, полученный фрагмент длиной 1,0 kb заполняют фрагментом Кленова ДНК- полимеразы, далее ДНК переваривают Pst1, полученный фрагмент клонируют в вектор pBSF2-L8, обработанный эндонукле- азами ВатН1 и Psf1, получают экспресси- онную плазмиду psFc R-1 для FcЈ R, одновременно Hindlll-EcoR1 фрагмент вставки из плазмиды LE392 клонируют в вектор pGEM4, получают рСЕМА4-Рс Р, которую обрабатывают EcoRI и Hindlll эндо- нуклеазами, 5 -выступающие концы затупляют с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 и четырех деоксинукле- озидтрифосфатов, 5-фосфатные группы удаляют, полученный фрагмент после очистки обрабатывают ЗаиЗА, больший фрагмент лигируют с олигодезоксинуклеотидами

72753346

ЕВ1496 и ЕВТ497 с помощью Т4-ДНК-лига- зы, далее ДНК лигируют с линеаризованной векторной ДНК, которую получают путем обработки плазмиды pRH 100 эндонуклеа5 зой Sstl, удаления 3 -выступающих концов и дефосфорилирования, и получают плазмиду pRH246 или одновременно дрожжевую плазмиду YEp13 гидролизуют Hindlll и BamHI рестриктазами и линеаризованный

10 вектор лигируют с Hlndlll-BamHI фрагментом длиной 1900 Ьр плазмиды pRH245 с помощью Т4-ДНК-лигазы, получают экс- прессионную плазмиду 289ЬЗ, ранее полученными плазмидами pRH246 и psFc R-1

15 трансформируют бактерии E.cofi НВ101, а экспрессионной плазмидой 289ЬЗ - дрожжевой штамм WS21-1, культивируют трансформированные штаммы с последующим выделением и очисткой целевого продукта с

20 помощью хроматографических методов.