Способ оценки иммунорегуляторной активности лимфоцитов Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, точнее к клинической иммунологии, и может быть использовано для диагностики расстройств иммунорегуляторных процессов в иммунной системе.

Цель изобретения - повышение точности способа и его упрощение.

Способ осуществляется следующим образом.

При проведении экспериментов по оценке иммунорегуляторной активности берут три сосуда для культивирования со средой культивирования. В первый сосуд помещают две полупроницаемые мембраны AI и Аа, на которые наносят по 0,5x10 исследуемых мононуклеарных клеток, а в среду культивирования добавляют конканавалин А таким образом, что его концентрация составляет 5 мкг/мл. Во второй сосуд помещают такие же две полупроницаемые мембраны Вт и В2, на которые также наносят по 0,5x106 исследуемых клеток, но вереду культивирования конканавалин А не добавляют. В третий сосуд помещают полупроницаемые мембраны Ci и С2, на которые не наносят исследуемых клеток, а в среду культивирования не добавляют конканавалин А. Все три сосуда с мембранами инкубируют при 37°С 24 ч. За это время на мембранах AI и А2 под влиянием конканавалина А происходит индукция иммунорегуляторных клеток.

На следующем этапе эксперимента для того, чтобы определить, как иммунор егуля- торные клетки, индуцированные на мембранах AI и А2, влияют на пролиферацию лимфоцитов на мембранах Bi и В2, и наоборот, совмещают мембраны AI и Bi одну над

О О

ел

СА)

О

о

другой, разделенные тонким слоем среды культивирования, и стимулируют пролиферацию лимфоцитов на мембране Bi вторич- ным добавлением конканавалина А. Совмещение мембран А2 и Ci и добавление конканавалина А в среду культивирования обеспечивает контроль пролиферации лимфоцитов на мембране AI в отсутствие влияния лимфоцитов, растущих на мембране Bi.

Совмещение мембран Ва и С2 и добавление в среду конканавалина А обеспечивает кон1 троль пролиферации лимфоцитов на мембране Bi в отсутствие влияния со стороны лимфоцитов, растущих на мембране Аи Все

три сосуда с совмещенными мембранами

| инкубируют при 37°С еще 72 ч, а затем на каждой мембране в отдельности определяют уровень пролиферации лимфоцитов радиоиммунологическим методом.

10 мл крови здорового донора, взятой в раствор с этилендиаминтетрауксусной кислотой (10 мл крови на 2 мл 2,7%-ного раствора) наслаивают на раствор фиколла- верографина, имеющего плотность 1,077. После центрифугирования при 400 G 45 мин собирают мононуклеарные клетки, сконцентрировавшиеся над слоем фиколла, трижды отмывают центрифугированием в фосфатном буфере (1500 об/мин 15 мин), ресуспендируют в среде 199, содержащей

0

5

0

5

0

20% инактивированной сыворотки человека, антибиотики, глютамин. Доводят концентрацию клеток до ЮхЮ6 в мл. Нанесение мононуклеарных клеток на мембраны, культивирование и совмещение мембран осуществляли согласно методике. Уровень пролиферации составил: на мембране AI 1048 имп/ммн, на мембране А2 839 имп/ммн, на мембране Bi 537 имп/мин, на мембране В2 3820 имп/мин, на мембранах Ci и С2 60 имп/мин.

Таким образом, популяция мммунорегу- ляторных клеток, индуцированных на мембране AI, подавляла пролиферацию лимфоцитов на мембране BI по сравнению с их пролиферацией в аналогичных условиях, но при отсутствии влияния со стороны иммунорегуляторных клеток (совмещение мембран Вг и С2). Популяция лимфоцитов, пролиферирующих на мембране BL стимулировала рост иммунорегуляторных клеток на мембране Ai no сравнению с их ростом в отсутствии влияния со стороны лимфоцитов мембраны Ai (совмещение мембран Аа и Ci),

Для характеристики степени регулирующего влияния, оказываемого лимфоцитами мембраны AI на пролиферацию лимфоцитов на мембране В-,, вычисляли индекс регуляции (ИРО

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики растройств иммунорегуляторных процессов в иммунной системе по оценке иммунорегуляторной активности лимфоцитов. Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа. Для этого исследуемые лимфоциты делят на две части, каждую из которых культивируют в течение 24 ч на полупроницаемых мембранах, одну - в присутствии конканавалина А, а другую - без него, после чего мембраны с лимфоцитами располагают друг над другом в среде с конканавалином А и культивируют 72 ч совместно, в условиях, исключающих возможность смешивания популяций, регистрируют пролиферативную активность лимфоцитов об обоих популяциях. Способ позволяет сократить время исследования и получить больше информации об иммунорегуляторной активности лимфоцитов, что повышает точность исследования.

/ уровень пролиферации на мембране BI)

уровень пролифе

на мембране Ва

уровень пролиферации на мембране &2

Для характеристики степени регулирующего влияния, оказываемого лимфоцитами, растущими на мембране Bi, на

/ уровень пролиферации на мембране AI

}

уровень пролифе на мембране А2

уровень пролиферации на мембране Аа

Для данного донора величина HPi составила - 16%. а ИР2 24%.

П р и м е р 1. Выделяли мононуклеарные клетки из крови больной системной красной волчанкой и разносили их на полупроницаемые мембраны. После культивирования клеток, совмещения мембран, оценки пролиферации на каждой из них и вычисления индексов регуляции получили следующие результаты: уровень пролиферации на мембране Ai 2500 имп/мин, AZ 500 имп/мин, Bi 1500 имп/мин, В2 1570 имп/мин, ИР1 - 4,5%, ИРа 400%. Эти данные указывают на отсутствие выраженного супрессор- ного действия иммунорегуляторных клеток

уровень пролиферации

на мембране Ва

/

на мембране &2

- X 130

пролиферацию иммунсрегуляторных клеток на мембране AI, вычисляли индекс регуляции (ИР2)

уровень пролиферации на мембране А2 /

на мембране Аа

X 100

мембраны AI на пролиферацию л, (фоцмтоз мембраны В2.

П р и м е р 2. Выделяли иононуклеарные клетки из крови больного с вторичным иммунодефицитом, разносили на полупроницаемые мембраны. После культивирования клеток, совмещения мембран, оценки пролиферации на каждой из них м вычисления индексов регуляции получили следующие результаты: уровень пролиферации на мембране AI 1400 имп/мин, А2 700 имп/мик, Bi 100 имп/мин, 82 2100 имп/мин, HPi -91 %, ИР2 100%. Таким образом, на про- лифермрующих клетках мембраны Bi зарегистрировано гиперсупрессорное действие, оказываемое иммунорегуляторньши клетками, растущими на мембране AI (ИPi - -91 %), а на иммунорегуляторных клетках мембраны AI зарегистрировано хелперное (усиливающее) действие, сказы ваемое на них пролиферирующими клетками мембраны Bi (ИР2 100%).

Таким образом, предлагаемый способ в отличие от известного является более быстрым, экономичным, более оправданным с точки зрения врачебной этики, а также дающим больший объем научной информации о процессах взаимодействия популяции им- мунокомпетентных клеток у человека, позволяющей повысить точность способа. Нарушения таких взаимодействий приводят к возникновению различных иммунопатологических состояний. Положительный эффект изобретения заключается в разработке простого, пригодного для клиники способа, позволяющего регистрировать нарушения таких взаимодействий, контролировать эффективность иммунокоррегиру- ющей терапии вторичных и первичных иммунодефицитов, в том числе и синдрома

0

5

0

5

приобретенного иммунодефицита, проблемы диагностики и лечения которого привлекают в настоящее время внимание исследователей всего мира.

Формула изобретения Способ оценки иммунорегуляторной активности лимфоцитов путем культивирования исследуемых лимфоцитов в присутствии конканавалина А с последующим их взаимодействием с тест-системой лимфоцитов того же донора и оценкой пролифе- ративной активности тест-системы, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа и его упрощения, культивирование исследуемых лимфоцитов и тест- системы осуществляют одновременно на отдельных полупроницаемых мембранах в течение 24 ч, взаимодействие лимфоцитов ведут путем расположения мембран друг над другом в среде, содержащей конканава- лин А в течение 72 ч, и дополнительно оценивают пролиферативную активность исследуемых лимфоцитов.