Способ получения иммобилизованных пекарских дрожжей SасснаRомYсеS ceReVIcIae Советский патент 1991 года по МПК C12N11/00 C12N11/12 

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к способам получения биокатализаторов с иммобилизованными клетками путем включения их. в гель, и может быть использовано для инвертирования сахарозы

Цель изобретений - удешевление способа при сохранении высокой ферментативной активности целевого продукта.

Способ заключается в иммобилизации пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae в геле на основе карбокси метилцеллюлозыо Клетки микроорганизмов вносят в водный раствор кислого полисахарида и сшивают с ним многовалентными ионами металлов, при этом в качестве полисахарида используют соль карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), например натриевую, со степенью замер

щения по карбоксиметильным группам 0,5 - 1,2 и со степенью полимериза - ции 300 «- 3QOO и иммобилизуемый териал суспендируют в растворе соли карбоксиметилцеллюлозы в соотношении по абсолютно сухой массе 0,3 - 4,5° Сшивание выполняют растворами солей алюминия: алюминиевых квасцов, суль - фата алюминия, нитрата алюминия, ацетата алюминия, - а также раствора ми солей трехвалентного железа„

Варьируя указанными параметрами носителя, можно в определенных делах регулировать свойства геля, и, соответственно, менять физические, физико -кимические и технологические свойства самого-биокатализатора, лая его наиболее пригодным для того или иного вида применяемого обору- дованияь

Степень полимеризации КМЦ и ношение сухих масс иммобилизуемых клеток и КМЦ существенно влияют на диффузионное сопротивление гелевой матрицы, что позволяет получить биск- катализаторы с различной активностью

Чример 1 о Готовят следующие водные растворьь

Ас 5%г-ный Na-КМЦ марки 70/740 (первая цифра означает, что в моле« куле Na-КМЦ средняя степень замещег- ния по карбоксиметильным группам равна 0,7, а вторая указывает етее- пень полимеризации в молекуле Na-КМЦ

Бо 5%«-ный раствор алюмоаммонийр- ных квасцов Јмн4А1(804)г« Оба раствора стерилизуют 15 мин при 120°Се В 2 мл раствора А суспендие- руют протиранием в ступке 0,2 г сухих дрожжей S0 cerevisiae (раса Р 21 выделенная в Институте микробиологии имо АоКирхенштейна) с инвертазной активностью 8100 еде на 1 г абсолют но сухих дрожжейо Суспензию продав ливают через капилляр диаметром 1,5 мм, конец которого находится и передвигается непосредственно над поверхностью раствора Бо Полученный жгут выдерживают в растворе В в тече ние получаса,. Жгут вынимают из раст вора и протирают через сито из прово лочной ткани с квадратными ячейками размером стороны в свету 0,63 мм„ При растирании сито промывают дистнлли - рованной водой и на другом подобном сите с размером стороны ячейки в све« ту 0,25 мм отбирают фракцию с разме- ром частиц 09 25 0,63 мм. Частицы

0

5

0

5

0

5

0

5

биокатализатора промывают на сите 1,0 л 0,05 М ацетатного буфера (рН 4,8), после чего внешнюю влагу удаляют на фильтровальной бумаге.

Содержание сухого вещества в лизаторе 18,9%, инвертазная актив« ность 864 ед„ на 1 г влажного лизатора Показатель загрузки геля клетками (тсе0 соотношение сухой сы клеток и сухой массы Na-КМЦ) 2,4 Степень сохранения инвертазной актйв ности 80%о

Инвертазную активность определяют инкубированием навески образца в растворе сахарозы в 0,05 М ацетатном буфере (рН 4,8) при 30Ј, +0,5°Со Моносахара после инкубации определяют комплексометрически по восстановлению двухвалентной меди„

За единицу активности принята способность 1 г дрожжей (или биоката лизатора) инвертировать 1 мкмоль харозы за 1 мин в указанных условиях.

Пример 20 Аналогично приме - ру 1 готовят биокатализатор из той же партии дрожжей S. cerevisiae, За грузка матрицы 0,3« У полученного инвертазного биокатализатора содёр жание сухого вещества 18,1% Инвёр - тазная активность 306 едс на 1 г ного катализаторас

Пример 30 Аналогично приме«- ру 1 готовят биокатализатор их сухих дрожжей S cerevisiae, которые имеют инвертазную активность 5710 ед0 на 1 г сухого веса„ Используется другая марка Na-КМЦ «- 70/450 0, а затель загрузки геля равен 30 При протирке используют набор сит с мерами сторон ячеек 0,5 и 1,0 мм

Степень выживания клеток после иммобилизации 93,2%,

12,4 г влажного биокатализатора (содержащего 22,5% сухого вещества и имеющего инвертазную активность 2890 еДо на 1 г сухого вещества) помещают в стеклянную хроматографи - ческую колонку с внутренним диамётг- ром 26 мМо Колонку помещают в камеру воздушного термостата, в котором поддерживают температуру на уровне 55+2дСо Колонку соединяют с пери«- стальтическим насосом и сборниками растворов. В колонку подают 60%«-ный раствор сахарозы, приготовленный из сахара«-песка для промышленной пе«- реработкио Проток раствора в течение всего опыта составляет 1,45+0,5 об„

раствора на 1 об„ начального слоя биокатализатора (начальная высота слоя равна 60 мм и определяется пос« ле установления указанного режима потока)о

В первые 2 сут степень инверсии в среднем 97,2% и часовая производи - тельность по инвертированной сахароз в среднем 1t20 г на 1 л насыпного слоя биокатализатора. В течение 12 сут степень инверсии выше 80%, и в течение 18 сут степень инверсии выше 50%„

Полученный сироп прозрачен, и дан ные оптической плотности свидетель«- ствуют, что дополнительно красящие вещества не образовываются

Степень инверсии устанавливают по содержанию моносахаров, применяя тот же комплексометрический метод, что при определении инвертазной ак«ТИВНОСТИо

Степень выживания клеток опредег- ляют подсчетом мертвых клеток и обще« го числа клеток на люминесцентном микроскопе при окрашивании их приму- лином, Гель разрушают раствором ратного буфера

Пример 4 о Готовят биокатали« затор из той же партии дрожжей, как в примере 30 Загрузка матрицы 1,2 Активность загружаемого катали ,атора 466 ед„ на 1 г влажного катализатора при содержании в нем сухого вещества 21,9%о Колонну заполняют 12,0 г влажного катализатора о раст« вор сахарозы подают в течение 2 сут при протоке 1,10 Средняя степень ин«- версии 95,6%, расчетная средняя часо« вая производительность 840 г инвер - тированной сахарозы на 1 г насыпного слоя биокатализатора о

Пример 5оИз60г Na-КМЦ (содержание сухого вещества 88%) мйр« ки 70/450 О готовят 4,5%«-ный раст«- вор в дистиллированной воде0 Стери лизуют в течение 15 мин при 1200С„

Приемы приготовления частиц био« катализатора существенно не отличают- |ся от описанных в примере 1, а харак терные особенности даны ниже,

В опытах используют 850 г прессо«- ванных пекарских дрожжей рода Saccha- romyces cerevisiae (раса ЛК 14) за«- водского изготовления с инвертазной активностью 1240 ед„ на 1 г сухих дрожжей. Влажность дрожжей 76,6%. Диспергируют в ступке несколькими

порциями а В качестве раствора сши«- вающей соли используют 5%«-ный раствор алюмокалиевых квасцов ЈА1 K(SO)a x х Нити, полученные из сопла диаметром 1,5 мм, выдерживают в воре в течение 30 мин Полученный гель протирают через сито с размером ячейки 2,5 мм и собирают фракции

Q частиц 0,63 f 2,5 мм Частицы промы - вают дистиллированной водой.

Расчетный коэффициент загрузки геля биокатализатором в этом опыте равен 3,77о

5 Полученные частицы имеют актйв«- ность 166 ед. на 1 г влажных частиц при их влажности 77,2%. Соответст - венно, степень сохранения активности равна 74,3%о

0 495 г полученных влажных частиц загружают в цилиндрический сосуд тзе - актор, дно которого образовано из ла«- тунной сетки с натянутым материалом из капрона0 Реактор имеет рубашку

5 для обогрева.

Реактор, установленный на лабора«- торном ферментационном стенде , соединяют с системой подачи раствора сахарозы, состоящей из обогреваемого

0 сосуда с раствором сахарозы, шлангов и перистальтического насоса

Раствор сахарозы с концентрацией 65% подают сверху в реактор с темпе ратурой 56+2°С В рубашку реактора подают горячую воду и температуру в слое биокатализатора поддерживают (по показаниям термометра) на уровне 65+1°С. По достижении указанного пературного режима объемную скорость

Q потока устанавливают в пределах 1,10+0,05 л/ч (в пересчете на нор мальные условия)0

Продукт собирают в типовом (для 5 данной установки) конусном фермента ционном сосуде и вторым перистаЛь тическим насосом отводят из установки.

Опыт продолжают 13,5 ч Получают 19,7 кг продукта со средней степенью 0 инверсии 91,6%. Средняя производительность 0,56 кг инвертированной саг- харозы на 1 л эффективного объема слоя катализатора за 1 ч

В нескольких образцах исходного 5 раствора и продукта определяют с од ер жание оксиметилфурфурола (ОМФ). рост последнего 1-10 - 2,, максимальное содержание в продукте 7,5.

5

ОМФ определяют после подготовки анализируемого раствора (нейтрализа - цией, осаждением основным уксусйо - кислым свинцом) путем измерения опти«- ческой плотности при 282 нм этил«- ацетатного экстракта

Пример 60 Биокатализатор товят аналогично примеру 1, но исполь- зуют другую партию сухих дрожжей S. cerevisiae. Инвертазная активность влажного катализатора равна 487 ед/г

Полученную партию катализатора де лят на две части; одну помещают в за 16665368

В случае использования сульфата

г-меди в ходе определения инвертазной

активности практически все частицы катализатора разрушаются„

Пример 8оВ водном растворе Na-КМЦ марки 70/450 О с концентраг- цией 3,75% диспергируют в ступке прессованныепекарские дрожжи S cerevisiae в таком соотношении по сухой массе, чтобы коэффициент загрузки геля был равен 6,10 и 12 Для каждой величины этого коэффициента готовят по 3 повторных смеси Выдавливают

10

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения биокатализаторов с иммобилизованными клетками путем включения их в гель. Целью изобретения является удешевление способа при сохранении высокой ферментной активности целевого продукта. Способ заключается в ионном сшивании водного раствора карбоксиметилцеллюлозы с суспендированным иммобилизуемым материалом (пекарскими дрожжами SACCHAROMYCES CEREOISIAE) многовалентными катионами металлов, применяемых в виде отдельно приготовленного водного раствора соли. В способе используют натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы (NA - КМЦ) и сшивают катионами алюминия или трехвалентного железа, а процесс выполняют при обычных температурах. Соотношение сухих масс иммобилизуемого материала и NA - КМЦ составляет от 0,3 до 4,5. Используют NA - КМЦ со степенью замещения от 0,5 до 1,2 и степенью полимеризации от 300 до 3000. Способ позволяет удешевить процесс иммобилизации при сохранении высокой ферментативной активности целевого продукта. 1 табл.

крытый сосуд и выдерживают в холодиль : суспензии через сопло диаметром

, Л

ной камере при 4 С, а другую сушат на воздухе при комнатной температуре в течение 16 ч на фильтровальной магво

Операционную стабильность катали заторов в обоих случаях определяют в одинаковых реакторах с барботажным воздушным перемешиванием, в которые непрерывно подают раствор са харозы при 56+2°Со Среднее время бывания субстрата в реакторе 180 мин Загрузка реакторов катализаторами в пересчете на сухую массу одинакова0

В случае влажного катализатора степень конверсии снижается ниже 50% после 135 ч действия, в случае шенного р- после 290 ч„

Пример 7 о Из Na-КМЦ марки 70/450 О готовят 3975% ный водный раствор, в котором суспендируют сованные пекарские дрожжи заводского изготовления S. cerevisiae (раса ЛК 14) с инвертазной активностью 1675 ед на 1 г сухого вещества „ Коэф«- фициент загрузки геля клетками 3,5

Через сопло 1,5 мм выдавливают нити суспензии в 5%«-ньк растворах различных солей, выдерживают в течег кие 30 мин Нити каждого вида отдель«- но протирают через сито и собирают фракции 1,0 - 2,5 мм„

Определяют инвертазную активность, содержание сухого вещества и рассчитывают степень сохранения инвертазной активностис

Получены следующие результаты:

20

25

30

35

40

45

50

1 э 5 мм в 5%«-ный раствор алюмокал вых квасцов о Нити выдерживают в воре 30 мин о Далее нити протираю рез сито с размером ячеек 2,5 м частицы на сите промывают дистил ванной водой (3 л на 1 г взятог КМЦ) « Промывные воды собирают о дельно для каждого варианта и п ности. После 15«-минутной cenHMe ции верхний слой воды сливают и осадку присоединяют весь остато сите. Еще 3 раза промывают водо перемешиванием, седиментацией и кантациейо Затем осадок просуши на фильтровальной бумаге, взвеши и определяют содержание сухого щества.,

Расчет выхода сухого вещества собранных осадках показывает, ч геле удерживается только часть тых дрожжей и в биокатализаторе эффициент загрузки геля клетками ходится в пределах 4,35 4,5 во всех взятых с повторностями соот шениях„

I

Пример 9«Из Na-КМЦ мар 55/500 готовят 3%«-ный водный ра вор, в котором суспендируют сухи дрожжи 8„ cerevisiae (раса Р 21 влажностью 72% и инвертазной акт ностью 3460 ед на 1 г абсолютно хих дрожжей с Показатапь загрузки геля клетками 3,0Ь

Сшитый катализатор получают а логично примеру 1, только в кач раствора Б применяют 5%«-ный раст сульфата алюминия. Образовавший гель протирают через сито 2,5 мм отбирают фракцию частиц ,5 мм

Степень сохра«- нения активносг- ти, % от исходной

79,6

61,4

57,4

32,1

0

5

0

5

0

5

0

5

1 э 5 мм в 5%«-ный раствор алюмокалие«- вых квасцов о Нити выдерживают в раст«- воре 30 мин о Далее нити протирают рез сито с размером ячеек 2,5 мм и частицы на сите промывают дистиллиро«- ванной водой (3 л на 1 г взятого Na- КМЦ) « Промывные воды собирают дельно для каждого варианта и повтбрг ности. После 15«-минутной cenHMeHTar- ции верхний слой воды сливают и к осадку присоединяют весь остаток на сите. Еще 3 раза промывают водой с перемешиванием, седиментацией и Де«- кантациейо Затем осадок просушивают на фильтровальной бумаге, взвешивают и определяют содержание сухого Bef щества.,

Расчет выхода сухого вещества в собранных осадках показывает, что в геле удерживается только часть взяг- тых дрожжей и в биокатализаторе ко эффициент загрузки геля клетками ходится в пределах 4,35 4,5 во всех взятых с повторностями соотно« шениях„

I

Пример 9«Из Na-КМЦ марки 55/500 готовят 3%«-ный водный раст«- вор, в котором суспендируют сухие дрожжи 8„ cerevisiae (раса Р 21) с влажностью 72% и инвертазной актив - ностью 3460 ед на 1 г абсолютно су«- хих дрожжей с Показатапь загрузки геля клетками 3,0Ь

Сшитый катализатор получают анаг- логично примеру 1, только в качестве раствора Б применяют 5%«-ный раствор сульфата алюминия. Образовавшийся гель протирают через сито 2,5 мм и отбирают фракцию частиц ,5 мм.

Инвертазная активность катапизаг- тора 420 ед/г при влажности 78,3%, следовательно, расчетная степень сохранения активности 74,6%„

Пример ЮоИз Na-КМЦ марки 85/350 готовят 3%«-ный раствор и да«- лее действуют алалогично примеру 9,

Инвертазная активность катализа - тора 387 ед/г при влажности 79,8%, степень сохранения активности 73,8%,

Пример 11„Из Na-КМЦ марки 70/300 готовят водный раствор и далее действуют, как в примере 9«

Полученный катализатор с влажное тью 80,4% имеет инвертазную актив - ность 382 ед/г, степень сохранения активности 75,2%,

Пример 12. Из Na-КМЦ со

степенью замещения по карбоксиме - тильным группам 0,838 и средней сте«- пенью полимеризации 1196 готовят 3%«--ный водный раствор Далее дейЈт«- вуют, как в примере 9„

Катализатор имеет инвертазную активность 424 ед/г, влажность 77,5%о Степень сохранения активности

J72,6%0

Пример 13. Готовят 3%г-ный раствор Na-КМЦ марки 70/450 О, ис пользуют дрожжи, как в примере

Для сшивки готовят и используют отдельно 5%0-ные растворы разных лей алюминия.

Результаты опыта:

Соль, испольэо«- Степень coxpat ванная для сшивки нения инвертаз

ной активности дрожжей, %

A1U(S04)5- 18H20 . 73,4 А1(Ж)3)3-9НгО70,8

,А1С1з 6HZ067,5

Ацетат аммония76,4

Таким образом, предлагаемый спо«- соб получения препаратов иммобилизо - ванных дрожжей позволяет получить препараты с высокой степенью сохра« нения ферментной активности иммоби« лизованных клеток ввиду отсутствия в среде иммобилизации биохимически сильнодействующих катионов, например кальция, и благодаря возможности им«

(j

5

0

5

Q 5

0

5

мобилизовывать при оптимальной температуре, достичь в препаратах высокого содержания иммобилизованных клеток при хорошей операционной и термической стабильности и хороших механических и термомеханических свойствах препаратов, что также со« действует высокой их ферментной тивности, выполнить весь процесс простыми энергомапоемкими операциями в несложном оборудовании и быстро, что способствует сохранению ферментной активности, применить относительно дешевые и доступные материалы, кроме того, проводимые технологические опе рации и применяемые материалы не BW зывают трудности в аспектах промса нитарии и экологии, что также crto собствует удешевлению способа (уДе«- шевление способа прежде всего дости - гается более низкой стоимостью йс«- пользуемой вместо альгината КМЦ).

Формула изобретения

Способ получения иммобилизованных пекарских дрожжей Saccharomyces ce- revisiae, заключающийся в суспенди ровании дрожжей в водном растворе кислого полисахарида с последующим гелеобразованием путем сшивания поли« сахарида катионами металлов, приме«- няемых в виде отдельно приготовленных растворов солей, отличающий - с я тем, что, с целью удешевления способа при сохранении высокой фёрг- ментативной активности целевого дукта, в качестве кислого полисахарид да используют натриевую соль карбокси - метилцеллюлозы со степенью замещения по карбоксильным группам 0,5 1,2 и степенью полимеризации 300 «- 3000, устанавливая соотношение дрожжи :нат«- риевая соль карбоксиметилцеллюлозы 0,3 - 4,5 по сухой массе, а в качест ве источника катионов металлов « соли алюминия или трехвалентного железа