Способ идентификации сортов сахарной свеклы Советский патент 1991 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к биохимическим методам сортовой идентификации.

Цель изобретения - повышение точности определения.

Способ состоит в том, что после электрофореза анализу подвергают функциональные белки-ферменты отдельного семени, а затем на основе зяектрофоретиче- ских спектров подсчитывают частоты встречаемости генотипов по ферментным локусам, по которым судят об идентичности или отличии исследуемых сортов.

Способ осуществляют следующим образом.

Определяют идентичность или отличие семян различных сортов.

Для анализа берут выборки в 50-100 семян исследуемых сортов. Размер выборки обусловлен использованием критерия X при математической обработке полученных данных.

Семена освобождают из околоплодников, измельчают на предметном стекле в капле воды или буфере. В полученной суспензии смачивают кусочек хроматографической бумаги Ватман 3 мм размером 3x5 мм. который затем вставляют в стартовую щель гелевого блока для электрофореза. Гелевый блок готовят из гидролизованного крахмала.

Способ приготовления гидролизованного крахмала следующий.

Промышленный пищевой картофельный крахмал в количестве 250 г помещают в литровую широкогорлую колбу и ставят в термостат при 37°С. Отдельно готовят подкисленный раствор ацетона. Для этого в пол-литровую бутыль, содержащую 0,5 л ацетона, добавляют 15 мл концентрированной соляной кислоты (ОСЧ), закрывают пробкой и ставят в термостат при 37°С. После того, как крахмал и ацетон прогреваются до 37°С, реакцию гидролиза запускают, выливая подкисленный ацетон в крахмал Время гидролиза крахмала 15 мин. Останавливают гидролиз добавлением 250 мл 1 М раствора ацетата натрия. Каждый образец

I

О

VI ю о о о

крахмала с определенным временем гидролиза тщательно обмывают на воронке Бюх- нера десятикратным количеством дистиллированной воды, после чего осушают его на воронке ацетоном (100 мл), затем раскладывают на лист фильтровальной бумаги и сушат при комнатной температуре.

Первоначальную оценку крахмала проводят по качеству приготовленного из него геля. Для приготовления геля берут 20 г гидролизованного крахмала, 20 г сахарозы и 140 мл 0,75 М трис-цитратного буфера, рН 7,0, гелевого буфера и помещают в колбу объемом 500 мл. Смесь разогревают на электроплитке или газовой горелке при непрерывном помешивании. Если время гидролиза подобрано правильно, то раствор крахмала при нагревании сначала загусте- .вает, а при дальнейшем нагревании разжи- жается и начинает кипеть с большим количеством мелких пузырьков воздуха. Нагревание продолжают до появления крупных редких пузырьков воздуха, после чего нагревание прекращают. В нормаль- ном хорошем крахмале пузырьки воздуха сразу исчезают и раствор становится прозрачным.

Горячий раствор крахмала заливают в кювету, в которой он полимеризуется в те- чение 1,5-2 ч. Полностью заполимеризовав- шийся гель должен быть достаточно прочным и эластичным.

Гель в заправленной кювете имеет центральную горизонтальную часть, которая переходит, не прерываясь, в две боковые вертикальные части, предназначенные для непосредственного контакта геля с электродным буфером. Перед нанесением образцов гель охлаждают в холодильнике до 2-4°С, не допуская его замораживания,

Для электрофореза используют трис- цитратную буферную систему. Электродный буфер 0,1 М трис-цитратный, рН 7,0. Целесообразно использовать в одном при- боре ферменты с близкой электрофоретиче- ской подвижностью, что позволяет использовать гелевый блок соответствующего размера и, следовательно, экономить материал и время.

После окончания электрофореза гель извлекают из кюветы, разрезают на пластинки толщиной 1,5 мм и окрашивают на соответствующие ферменты (табл.1).

В среду для малик-фермента добавляют 2 мг MgCl2,

Пластины геля инкубируют при 37°С до четкого проявления. Затем зимограммы промывают водой, зарисовывают или фотографируют спектры изоферментов,

Зимограммы фиксируют в смеси глицерин - вода (4:10) в течение сут при 4°С, затем покрывают с обеих сторон листками целлофана и высушивают. Высушенные пластины хранят длительное время в темноте, в сухом месте.

На электрофореграммах получают спектры ферментов разной подвижности. Далее подсчитывают количество семян с каждым вариантом генотипа по данному ферменту в общей выборке и определяют частоту встречаемости генотипов. Например.сравнивают два сорта Белоцерковская одн. 34 и Рамон- ская одн. 32 по малик-ферменту (табл.2).

Показатель г сходства этих двух популяций вычисляют по формуле

,521-0,527 +V0,208-0,309 +

+ 4X271 0,164 0-875.

Значение показателя г не превышает 1. Оно равно 1 в тех случаях, кЧ)гда сравниваемые сорта идентичны по частотам встречаемости. Показатель г 0, когда сравниваемые популяции не имеют ни одного общегр аллеля. В остальных случаях показатель г сходства имеет промежуточное значение между 0 и 1. Показатель г сходства является мерой попарного сходства популяций. Его можно интерпретировать как частоту общих аллелей в сравниваемых сортах,

После вычисляют критерий идентичности

, 8 NI N2

N1 +N2

(1-2)

где NI - общая выборка семян в первом сорте;

N2 - выборка семян во втором сорте.

0-0,875) 2,39.

Величина I распределена так же, как и X , если превышает табличное значение X2 с заданным уровнем значимости, то между выборками есть различие. X2 табл. 5,991 при уровне значимости Р 0,05%. И таким образом сравнивают все сорта друг с другом и по всем трем ферментным локусам.

По результатам математической обработки судят об отличии или сходстве срав- ниваемых сортов по частотам встречаемости изоферментных локусов.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример1.По указанной выше методике проводят анализы и последующую математическую обработку. Результаты представлены в табл.3. Идентификацию

сортов ведут путем сравнения частот встречаемости изоферментных локусов по величине критерия идентичности (X табл. 5.99),

Так как I (58,76) Х2табл.(5,99) по Mod -1, то по другим локусам проводить анализ (сравнение) нет смысла, сорта уже различаются.

П р и м е р 2. Все приемы аналогичны примеру 1, сравнивают другие сорта свеклы. Результаты представлены в табл.4.

По локусу Mod - 1 различий не обнаруживается, так как I (089) Х2 табл (5,99), поэтому необходимо сравнение по следующему ферменту (Мог-1). В данном случае I (10,04) Х2табл, т.е. сорта различа- ются, сравнение по третьему ферменту не обязательно.

П р и м е р 3. Все приемы проводят аналогично примеру 1. Результаты представлены в табл.5.

По локусам Mod -1 и Мог - 1 различий нет. Необходимо сравнение по третьему локусу. В данном случае I (78,0) X табл., т.е. сорта различаются по третьему локусу (изо- ферменту). При увеличении числа сравнива-

емых сортов может быть увеличено число изоферментов.

В табл.6 представлены показатели сходства и различия сортов сахарной свеклы по изоферментным локусам (значения критерия идентичности).

Настоящий способ достаточно точно позволяет устанавливать сходство или различие исследуемых сортов сахарной свеклы.

Формула изобретения Способ идентификации сортов сахарной свеклы, включающий электрофорез экстрагированных белков семян и анализ полученных электрофоретических белковых спектров с установлением идентичности или отличия исследуемых сортов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения.анализу подвергают спектры функциональных белков-ферментов, подсчитывают частоту встречаемости генотипов по ферментным локусам. по которой судят об идентичности или отличии сортов.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к биохимическим методам сортовой идентификации. Целью изобретения является повышение точности определения. Способ состоит в том, что проводят электрофоретический анализ функциональных белков-ферментов, на его основе подсчитывают частоту встречаемости генотипов по ферментным локусам, по которой судят об идентичности или отличии исследуемых сортов. 6 табл.

Состав инкубационных смесей для различных ферментов

Сравнение сортов свеклы по малик-ферменту

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3 Сравнительный анализ сортов свеклы Киргизская одн. 25 и Межотненская 070

Сравнение сортов свеклы Ялтушковская одн. и Белоцерковская одн. 34

Сравнение сортов Рамонская одн. 32 и Белоцерковская одн. 34

Таблица 6

Показатель сходства или различия сортов сахарной свеклы по изоферментным локусам (значение критерия идентичности)

По малик-ферменту 2,39

0,8920,97

0,4431,20

29,57

Таблица 4

Таблица 5

По глутаматдегидрогеназе БелоцерковПродолжение табл.6