Способ определения антитромбопластиновой активности биологически активного вещества Советский патент 1991 года по МПК G01N33/48 

(Л

С

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии и клинической фармакологии. Целью изобретения является повышение специфичности, ускорение и упрощение способа за счет выполнения In vitro. Определяют In vitro свертывания бестромбоцитарной субстратной плаз- ьы с коммерческим тромбопластином после его предварительной инкубации в течение 4-10 мин при Зб,5-37,5°С, в качестве контрольной пробы используется тромбопла- стин без инкубации с биологически активным веществом и по разнице между временем свертызачг.я в опасной и контрольной пробах СУДРТ об антитромбопла- стиновой активности 3 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии и клинической фармакологии.

Целью изобретения является повышение специфичности, ускорение и упрощение способа за счет выполнения in vitro.

В способе используют следующие реактивы: стандартный тромбопластин, 1 %- ный раствор (производство Львовского НИИ гематологии и переливания крови, содержащий белок концентрации 8 г/л, или производства кооператива Диагности- кум при Львовском НИИ гематологии и переливания крови, содержащий белок концентрации 7 г/л). 100 мг сухого тром- бопластина растворяют в 10 мл физиологи- ческого раствора при постоянном растирании при 40-45°С, раствор фильтруют. Из него готовят 0,04%-ный раствор тромбопластина путем соответствующего разведения физиологическим раствором:

1 мл 1%-ного раствора тромбопластина + 4 мл физиологического раствора - 0,2%-ный раствор; 1 мл 1%-ного разведения + 4 мл физиологического раствора - 0,04%-ный раствор

Используют также 0.277%-ный раствор хлористого кальция, 1,34%-ный раствор щавелевокислого натрия.

Бестромбоцитарную субстратную плазму готовят из цельной донорской крови (стабилизированной 1,34%-ным раствором щавелевокислого натрия всоотношении 9:1) путем центрифугирования ее в течение 10-30 мин при 3000 об/мин с тем, чтобы при добавлении к ней 0,1 мл 0,277%-ного раствора хлористого кальция время свертывания еесостазляло в среднем 120 с (контроль 1).

Смесь равных частей (по 0,5 мл) стандартного тромбопластина 0,04%-ного рас- творз и изучаемого препарата (вещества)

0s

ч

(Л

VJ о

VI

инкубируютвтечение5-6минпри37 ±0,1°С (опытная гроба).

Контроль 2 - стандартный раствор тромбопластина 0,04% на физиологическом растворе.

К 0,1 мл 0,277%-ного раствора хлористого кальция добавляют 0,1 мл 0,04%-ного раствора стандартного тромбопластина и через 10с инкубации при 37°С приливают 0,1 мл бестромбоцитарной субстратной плазмы. Отмечают время образования сгустка (контроль 2).

К 0,1 мл инкубационной смеси стандартно- го тромбопластина с изучаемым препаратом (веществом) добавляют 0,1 мл 0,277%-ного раствора хлористого кальция и через 10 с инкубации при 37°С приливают 0,1 мл бестромбоцитарной субстратной плазмы. Отмечают время образования сгустка (опыт). По разнице между временем свертывания субстратной плазмы со стандартным раствором тромбопластина (контроль 2) на физиологическом растворе и тромбопластина, предварительно инкубированного с фармакологическим или токсическим веществом, судят об антитром- бопластиновой активности последних, так как вещества, обладающие антитромбопла- стиновой активностью, удлиняют время свертывания субстратной плазмы, вызван- ное добавлением чистого тромбопластина.

Пример 1. Для определения анти- тромбопластиновой активности по предлагаемому способу готовят рабочий раствор стандартного тромбопластина 0,04%, со- держащего в 0,5 мл его объема концентрацию 0,2 мг/мл, и 0,2% раствора кокарбоксилазы:40 мг препарата растворяют в 10 мл физиологического раствора, 0,5 мл которого смешивают с соответствующим объемом тромбопластина. Смесь инкубируют при 37 ±0,1°С в течение 5-6 мин. Затем после введения инкубационной смеси вбес- тромбоцитарную субстратную плазму регистрируют время образования сгустка.

Результаты анализа показывают, что препарат кокарбоксилазы обладает выраженным антитромбопластиновым действием в условиях прямого взаимодействия препарата со стандартным тромбопласти- ном, о чем свидетельствует удлинение (в 3 раза) времени свертывания плазмы с 33 с (в контрольной пробе после добавления чистого тромбопластина) до 99 с.

П р и м е р 2. Для определения анти- тромбопластиновой активности этилового спирта по предлагаемому способу готовят рабочий раствор этанола концентрации 0,02 г/мл, 0,5 мл объема которого смешивают в 0,5 мл 0,04%-ного раствора стандартного тромбопластина, содержащего в этом объеме чистого вещества 0,2 мг/мл. Смесь инкубируют в течение 5-6 мин при 37 ± 0,1°С. Затем смесь вносят в бестромбоцитарную субстратную плазму и регистрируют время образования сгустка.

Результаты анализа показывают, что этиловый спирт обладает прямым антитромбопластиновым действием, о чем свидетельствует удлинение в ремени свертывания плазмы от 33 с (в контрольной пробе после прибавления чистого тромбопластина) до 59с.

П р и м е р 3. Для определения антитром- бопластиновой активности препарата уни- тиола по предлагаемому способу готовят реакционную смесь из 0,5 мл ампульного препарата унитиола (концентрации 5%, 5 мл) с 0,5 мл стандартного тромбопластина (концентрация 0,2 мг/мл). Смесь инкубируют в течение 5-6 мин при +37 ± 0,1 °С. После добавления инкубационной смеси в бестромбоцитарную субстратную плазму регистрируют время ее свертывания.

Результаты анализа свидетельствуют о наличии выраженного антитромбопласти- нового эффекта унитиола - время образования сгустка с 33 с (в контрольной пробе с введением чистого тромбопластина) удлиняется до 94 с.

П р и м е р 4. Для выявления антитром- бопластиновой активности препарата фенотипа по предлагаемому способу готовят смесь из 0,5 мл ампульного препарата фено- птина (концентрации 2,5 мг/мл) и 0,5 мл 0,04%-ного раствора стандартного тромбопластина, содержащего 0,2 мг/мл чистого вещества. Смесь инкубируют в течение 5-6 мин +37 ± 0,1°С, после чего смесь вносят в бестромбоцитарную субстратную плазму. Регистрируют время свертывания плазмы.

Удлинение времени свертывания плазмы с 33 с (в контроле с введением чистого тромбопластина) до 47 с указывает на умеренный антитромбопластиновый эффект феноптина в условиях прямого взаимодействия препарата с тромбопластином.

В табл.1 представлена сравнительная характеристика известного и предлагаемого способов.

Влияние температуры и длительности инкубации реакционной смеси препарата унитиола с тромбопластином на время свертывания бестромбоцитарной субстратной плазмы (с), п 22 показано в табл.2.

Достоверность различий определяют по отношению к контролю (контролем для чистого тромбопластина на физиологическом растворе служит бестромбоцитарная субстратная плазма, время свертывания которой 122 ±9,0 с.

Как видно из табл.2, положительный эффект препарата унитиола проявляется в условиях инкубации его с тромбопластином в температурном (+36-38°С) и временном (4- 10 мин) диапазонах.

Влияние температуры и длительности инкубации реакционной смеси этанола с тромбопластином на время свертывания плазмы (с), n 24 показано в табл.3.

Как видно из табл.3, этанол при прямом взаимодействии с тромбопластином оказывает антитромбопластиновый эффект в условиях инкубации реакционной смеси в температурном диапазоне 36-38°С в течение 4-10 мин выдержки.;

Таким образом, определение антитром-- бопластиновой активности биологически активных соединений по предлагаемому способу имеет ряд преимуществ по сравнению с известным: позволяет получить в условиях In vitro легко .воспроизводимые и достоверные результаты путем однократного измерения в течение 30-60 мин. По разнице с контрольной пробой результаты активности можно выразить количественно,

Показатели

Низкая

В условиях целостного организма (In vivo)

Да

16 дней-месяцы

Большое (исчисляемое граммами)

4-6

5-6

Нет Низкая

0

5

0

5

в то время как в известном способе об анти- тромбоплэстиновой активности судят косвенно.

Простота выполнения предлагаемого способа позволяет использовать его как для экспресс-оценки существующих препаратов на наличие (отсутствие) антитромбопла- стиновых свойств, так и для скрининга новых химических соединений с гемостазо- активной направленностью.

Формула изобретения Способ определения антитромбопла- стиновой активности биологически активного вещества путем определения времени свертывания плазмы в опытной и контрольной пробах, отличающийся тем что, с целью повышения специфичности и упрощения способа за счет выполнения In vitro, определяют время свертывания бестромбо- цитарной субстратной плазмы с коммерческим тромбопластином после его предварительной инкубации в течение 4-10 мин при 36,5- 37,5 С, в качестве контрольной пробы используют тромбопластин без инкубации с биологически активным веществом и по сравнению с временем свертывания в опытной и контрольной пробах судят об анти- тромбопластиновой активности.

1 а б л и ц а 1

Способ

известный

предлагаемый

орга

ам

Высокая

Ин витро Нет

30-60 мин

, Минимальное (миллиграм- ) мы)

1 0,1-0,2

Нет Низкая

Да Высокая

Таблица 2

Таблица 3