Способ определения активности тканевого тромбопластина Советский патент 1991 года по МПК G01N33/86 

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии, и касается способа определения тканевого тромбопластина.

Цель изобретения - упрощение способа за счет замены труднодоступных реактивов.

На чертеже показан график для иллюстрации предлагаемого способа.

П р и м е р 1. 1. Из 100 мг сырой ткани печени крысы получают гомогенат измельчением навески в гомогенизаторе стекло- стекло со скоростью 3000 об/мин, 5 мин в присутствии 1 мл 0,14 М раствора хлорида натрия. Гомогенат центрифугируют при ускорении 400 х а.Ю мин, надосадок центрифугируют с ускорением 145000 х д, 60 мин, супернатант отбрасывают, а осадок ресус- пендируют в 10 мл 0,14 М раствора хлорида натрия и повторяют центрифугирование. Надосадок отбрасывают, а осадок ресус- пендируют в 10 мл того же растворителя (взвесь тканевого тромбопластина).

2. КО. 1 мл пулированной донорской плазмы (от четырех доноров) добавляют 0,1 мл взвеси эритрофосфатида (0,8 мг/мл). 0.1 мл 0,14 М раствора хлористого натрия и 0,1 мл 0,025 М раствора хлорида кальция - определяют время свертывания (Тк). которое оказалось равным 103 с

3 К 0,1 мл той же пулированной плазмы добавляют 0,1 мл взвеси эритрофосфатида (0,8 мг/мл), 0,1 мл взвеси тканевого тромбопластина и 0.1 мл 0 025 М раствора хлорида кальция - определяют время свертывания (То) - оно оказалось равным 22 с. Отношение Тк/То оказалось равным 4,68, что выпадает из интервала 2 - 4. В связи с этим исходную взвесь тканевого тромбопластина разбавляют в 10 и 100 раз, проводят определения согласно п. 3 с обоими разведениями и устанавливают, что время свертывания равно 49 и 85 с соответственно для разведения в 10 и 100 раз, 103/49 и 103/85 равны соответственно 2,1 и 1,2. Первое значение лежит

Ё

Os СП 00

о ю

XI

в интервале от 2 до 4 и используется для расчета.

Расчет: на графике находят, что значению Тк/То, равному 2,1, соответствует активность тканевого тромбопластина в пробе, равная 1,05 ЕА. Умножают эту величину на 10 (приведение к 1 мл) и на 100 (разведение осадка в 10 и еще раз в 10 раз), а также на 10 (приведенные к 1 г сырой ткани). Результат - 10500 ЕА/г сырого вещества.

Пример 2. 1. Навеску ткани легких крысы помещают в гомогенизатор стекло- стекло и измельчают (3000 об/мин, 5 мин) в присутствии 1 мл 0,14 М раствора хлористого натрия. Гомогенат центрифугируют 10 мин с ускорением 400 х д, отделяют надоса- док и центрифугируют его 60 мин с ускорением 145000 х д, отбрасывают надосадок, суспендируют осадок в 10 мл 0,14 М раствора хлористого натрия, повторно центрифугируют в тех же условиях, отбрасывают надосадок, а осадок ресуспендируют в 10 мл того же растворителя (взвесь тканевого тромбопластина).

2.К 0,1 мл пулированной донорской плазмы добавляют 0,1 мл взвеси эритрофос- фатида (0,8 мг/мл), 0,1 мл 0,14 М раствора хлористого натрия и 0,1 мл 0,025 М раствора хлорида кальция - определяют время свертывания (Тк) 96 с.

3.К 0,1 мл пулированной плазмы добавляют 0,1 мл взвеси эритрофосфатида (0,8 мг/мл), 0,1 мл взвеси тканевого тромбопластина (из. п.1) и 0,1 мл 0,025 М раствора хлорида кальция - определяют время свертывания (Т0) 27 с. Отношение Тк/То 3,43, т.е. располагается в интервале между 2 и 4, следовательно, используется для расчета.

Расчет с помощью калибровочного графика показывает, что величина 3,4 (отношение Тк/То) соответствует 2,2 ЕА. Умножив это значение на 10 (приведение к 1 мл) и на 100(10 - приведение к 1 г сырого вещества, 10 - разведение исходного вещества), получают 2200 ЕА/г сырого вещества.

Воспроизводимость определений (а /М х х 100) при 10 повторностях составляет 4,2%. Конкретно для 10 параллельных определений активности тканевого тромбопластина

в ткани печени средняя величина равна 10210 ЕА/г сырой ткани (а) - 428,8.

В табл.1 показана сравнительная характеристика трудоемкости получения некоторых реактивов, используемых в предлагаемом

и известном способах.

В табл.2 показана сравнительная характеристика материалов и аппаратуры, используемая в известном и предлагаемом способах.

В табл.3 показана тромбопластическая

активность ткани мозга человека в условных

единицах активности (ЕА) на 1 г сырой ткани.

Из данных табл.3 видно, что результаты,

полученные с помощью предлагаемого способа, в достаточно концентрированных материалах не уступают по воспроизводимости и чувствительности результатам, полученным с помощью известного способа. При сильном разбавлении (1:20) воспроизводимость даже несколько выше в случае использования предлагаемого способа - отклонение от М уменьшено с 12,5% (известный) до 11,5% (предлагаемый).

Предлагаемый способ позволяет эаменить апопротеин III, а также фактор IX-де- фицитную плазму, для получения которой необходимо располагать больными с дефицитом этого фактора.

Формула изобретения

Способ определения активности тканевого тромбопластина путем инкубации плазмы с источником тромбопластина в опытной и контрольной пробах, определения времени рекальцификации плазмы и

построения калибровочной кривой зависимости времени рекальцификации от количества тромбопластина, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа за счет замены труднодоступных реактивов, в качестве контрольной пробы используют нормальную донорскую плазму, насыщенную эритрофосфатидом.

Таблица 1

Изобретение относится к медицине и касается способа определения активности тканевого тромбопластина Целью изобретения является упрощение способа за счет замены труднодоступных реактивов. Способ осуществляется путем инкубации плазмы с источником тромбопластина, определения времени свертывания плазмы и построения калибровочной кривой зависимости времени свертывания от количества тромбопластина В качестве контрольной пробы используют пулированную нормативную донорскую плазму, предварительно насыщенную неполным тромбопластином (коммерческим эритрофосфатидом) Способ позволяет исключить из определения апоп- ротеин III, а также фактор IX-дефицитную плазму. 1 ил. 3 табл

Таблица 2

Wb 4

з.

0,0006 9JD01B 0.003 0,0042 Конц. тромбопластина, мг/мл

Таблица 3

OJ005