Способ выявления нуклеотидных последовательностей Советский патент 1991 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано для диагностики возбудителей инфекционных болезней, идентификации микроорганизмов, а также в научных исследованиях.

Цель изобретения - ускорение способа и повышение достоверности его результатов за счет снижения вероятности неспецифических реакций.

При выявлении нуклеотидных последовательностей, комплементарных нуклеотид- ным последовательностям эталонного образца, предварительно на поверхность носителя наносят один или несколько эталонных образцов, а специфическую метку вводят непосредственно в исследуемый материал без очистки его нуклеотидных последовательностей.

Способ осуществляют следующим образом.

Эталонные образцы предварительно наносят на поверхность носителя, фиксируют их тепловой обработкой и предгибридизуют. Маркированию, например сульфированию, подвергают исследуемый материал без очистки его нуклеотидных последовательностей непосредственно в процессе лизиса бактериальных клеток или тканей, инфицированных вирусами, Общее время обработки и маркировки исследуемого материала до его взаимодействия с фиксированными на носителе эталонными образцами занимает 3 ч. Носитель с эталонными образцами подвергают взаимодействию с маркированным исследуемым материалом и отмывают избыток материала. Факт комплементарного взаимодействия нуклеотидных последовательностей эталонного образца и исследуемого материала устанавливают иммуноферментным методом.

Пример 1. Бактериальную культуру штамма E.coli TG I с плазмидой pTZ 18R выращивают с аэрацией при 37°С в L-буль- оне, содержащем 30 мкг/мл ампициллина, до концентрации 2х108 кл /мл. Бактериальсл С

о xj

00 00

oj

00

ную культуру лизогеиного по фагу /1 штамма E.coli CSH 45 ( Я С 1857S7) выращивают аналогичным образом в L-бульоне без антибиотика. Бактериальную культуру штамма B.subtills 168 выращивают в L-бульоне до насыщения (до концентрации 2x10 кл/мл). Клетки из 1 мл каждой бактериальной культуры осаждают центрифугированием при 20QOg в течение 5 мин и суспендируют в 0,2 мл ТЭН-буфера, содержащего 0,05 М трис- HCI, 0.001 М ЭДТА, 0.025М натрия хлористого, рН 8,0. Такие суспензии клеток используют в качестве исследуемого материала. Все дальнейшие операции, кроме специально указанных, проводят при комнатной температуре.

Для обработки и маркировки исследуемого материала предлагаемым способом к суспензии клеток прибавляют 0,05 мл раствора лизоцима в ТЭН-буфере с концентрацией 4 мг/мл. Через 10 мин добавляют 1,35 мл лизирующего раствора, содержащего 6,0 М гуанидинхлорида, 0,1 М ЭДТА, 0,05 М трис-HCI, рН 8,0, и перемешивают в течение 5 мин до полного лизиса клеток. Прогревают лизат при G5°C в течение 10 мин, затем пять раз пропускают лизат через иглу с помощью шприца на 5 мл. К лизату добавляют 2 мл раствора 1,0 М метилгидроксиламина, рН 6,0 и 8 мл раствора 2,0 М метабисульфита натрия, рН 6,0. Через 1,5 ч прибавляют 11,6 мл изопропилового спирта и выдерживают в течение 15 мин. Затем осаждают сульфированные нуклеотидные последовательности центрифугированием при SOOOg в течение 15 мин, Осадок дважды промывают 70%-ным этиловым спиртом, высушивают на воздухе в течение 15 мин и растворяют сульфированные нуклеотидные последовательности в 0,05 мл ТЭН-буфера. Общее время подготовки исследуемого материала к реакции комплементарного взаимодействия с эталонными образцами составляет 3 ч,

Дл я сравнения исследуемый материал обрабатывают на носителе - нитроцеллю- лозном фильтре в соответствии с известным способом. Суспензию клеток наносят на поверхность нитроцеллюлозного фильтра, ли- зируют раствором 0,5 М гидроокиси натрия в течение 10 мин, нейтрализуют раствором 1,5 М натрия хлористого, 1,0 М трис-HCI, рН 7,0 в течение 13 мин, затем фиксируют тепловой обработкой при 65°С в течение 2-12 ч,

Предгибридизацию проводят путем инкубации фильтра при 37°С в течение 3 ч в 10 мл гмбридизационного раствора, содержащего 50% формамида, 5хССР (1хССР соответствуе раствору 0,15 М натрия хлористого, 0,015 М натрия лимоннокислого), 0,02% фиколла, 0,02% поливинилпирролидона, 0,02% овальбумина, 0,1% додецилсульфата

натрия, 75 мкг/мл денатурированной прогреванием при 100°С и фрагментированной ультразвуком ДНК тимуса теленка. Общее время подготовки исследуемого материала на носителе составляет 5,5-15,5 ч. .

0 По 0,2 мл растворов овальбумина с концентрацией 1 мг/мл в ТЭН-буфере и ДНК тимуса теленка с концентрацией 1 мг/мл в ТЭН-буфере подвергают такой же физико- химической обработке предлагаемым спо5 собом, как и бактериальные клетки. Полученные препараты используют в качестве контрольных.

На нитроцаллюлозный фильтр наносят в виде отдельных точек по 0,01 мл растворов

0 сульфированных нуклеотидных последовательностей из бактериальных клеток и контрольных препаратов ДНК тимуса теленка и овальбумина. Фильтр высушивают на воздухе в течение 30 мин.

5Для выявления маркированного исследуемого материала и контрольных препаратов используют иммуноферментный метод. Фильтр помещают а 10 мл раствора для блокировки, содержащего буфер ФСБ сле0 дующего.состава: 0,007 М натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,003 М натрия фосфорнокислого однозамещенного, 0,12 М натрия хлористого. 0,02% глицина, 0,3% Твин-20, рН 7,4, с добавлением овальбуми5 на до конечной концентрации 0,2 мг/мл. Через 30 мин фильтр переносят в 10 мл буферу ФСБ, содержащего конъюгат имму- ноглубул(лнов кролика против сульфированной ДНК с перексидазой хрена в

0 разведении 1:200 и выдерживают в течение 1 ч. Фильтр отмывают три раза по 10 мин, каждую поомывку проводят в 20 мл буфера ФСБ. Затем фильтр погружают в 5 мл раствора хромогенного субстрата, содержаще5 го 0,2% бензидина, 0,4 М аммония хлористого, 3% перекиси водорода, 0,02 М ЭДТА, рН 6,0, Выдерживают 20 с, затем фильтр промывают водой и высушивают на воздухе в течение 15 мин. Оценку результа0 тов проводят визуально, считая за положительный появление сине-голубой окраски.

Из результатов следует, что иммунофер- ментным методом выявляются нуклеотидные последовательности исследуемого

5 материала и контрольной ДНК, но не выявляется препарат контрольного белка.

Представленные данные свидетельствуют, что предлагаемый способ позволяет вводить специфическую метку в исследуемый материал без очистки его нуклеотидных

последовательностей. При этом маркирование белка, составляющего основную часть примесей, не происходит. Общее время подготовки исследуемого материала к реакции комплементарного взаимодействия с эталонными образцами предлагаемым способом по сравнению с известным сокращается по меньшей мере на 2,5 ч.

Пример 2. В качестве эталонных образцов (зондов) используют ДНК плазми- ды pTZ 18R и фага Я. Для денатурации ДНК растворы зондов с концентрацией 0,2 мг/мл в ТЭН-буфере прогревают при 100°С в течение 10 мин. На три нитроцеллюлозных фильтра наносят в виде отдельных точек по 0,01 мл растворов зондов. Фиксацию зондов на фильтрах и предгибридизацию проводят в соответствии с известным способом. В качестве исследуемого материала используют суспензии бактериальных клеток штаммов E.coli TG I (pTZ 18R), E.coli CSH 45 ( A Cl 857S7) и Bac.subtilis 168, обработанные и маркированные по методике, описанной в примере 1. Фильтры с фиксированными эталонными образцами помещают в полиэтиленовые пакеты и вносят в каждый по 1 мл гибридизационной смеси, содержащей 0,95 мл гибридизационного раствора и 0,05 мл одного из препаратов маркированного исследуемого материала. Пакеты запаивают и инкубируют при 37°С в течение 24 ч. Удаляют из пакетов гибриди- зационные смеси. Фильтры отмывают в течение 45 мин, инкубируя их при 65°С в 200 мл раствора 5хССР, 0,1% додецилсульфата натрия, затем 5 мин в растворе 2хССР при комнатной температуре. Фильтры высушивают на воздухе в течение 30 мин.

Инкубацию фильтров в растворе для блокировки и в растворе коньюгата иммуноглобулинов кролика против сульфированной ДНК с пероксидазой хрена, отмывку фильтров и окрашивание комплементарных нуклеотидных последовательностей в растворе хромогенного субстрата проводят, как описано в примере 1.

Как следует из полученных данных, окраска появляется лишь в точках фиксации эталонных образцов, комплементарных нуклеотидных последовательностям маркированного исследуемого материала. Некомплементарные нуклеотидные последовательности предлагаемым способом не выявляются.

Таким образом, предлагаемый способ действительно позволяет выявлять в иссле- 5 дуемом материале нуклеотидные последовательности, комплементарные эталонным образцам, и применим для идентификации как бактерий, так и вирусов. По сравнению с известным способом, предлагаемый спо- 0 соб за счет снижения вероятности неспецифических реакций не дает ложно положительных результатов и они имеют однозначную интерпретацию.

Преимущества предлагаемого способа 5 перед известным - ускорение анализа и повышение достоверности его результатов путем снижения вероятности неспецифических реакций - достигаются за счет других отличительных признаков - маркировки ис0 следуемого материала (сульфирование) без очистки его нуклеотидных последовательностей и гибридизации маркированного материала с предварительно фиксированными на носителе эталонными образцами.

5Использованный метод детркции результатов гибридизации является качественным и не позволяет определять количество гибридных нуклеотидных последовательностей. Однако этот метод ис0 пользован лишь для иллюстрации принципиальной осуществимости предлагаемого способа и не является единственно возможным.

Формула изобретения

5Способ выявления нуклеотидных последовательностей, включающий подготовку носителя, исследуемого материала, эталонного образца, введение метки, проведение реакции комплементарного взаимодейст0 вия на поверхности носителя нуклеотидных последовательностей исследуемого материала и эталонного образца с последующей регистрацией результатов по наличию метки в продукте взаимодействия, отличаю5 щ и и с я тем, что, с целью ускорения способа и повышения достоверности его результатов за счет снижения вероятности неспецифических реакций, в качестве исследуемого материала используют лизат кле0 ток, метку вводят непосредственно в полученный лизат, а для проведения реакции на носитель наносят эталонный образец, а затем меченый исследуемый материал.

Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано для диагностики возбудителей инфекционных болезней, идентификации микроорганизмов, а также в научных исследованиях. Цель изобретения - ускорение способа и повышение достоверности его результатов за счет снижения вероятности неспецифических реакций. Предварительно на поверхность носителя наносят один или несколько эталонных образцов, а специфическую метку вводят непосредственно в исследуемый материал без очистки его нуклеотидных последовательностей.