Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в качестве парного проявляющего реагента в иммунофосфоресцентных методах анализа различных антигенных веществ.
Цель изобретения - получение штамма гибридомы, продуцирующего монАТ более высокой специфичности и с более высоким выходом.
Штамм получают.следующим способом.
Для иммунизации используют конъюгат Pd-копропорфирина 1 с бычьим сывороточным альбумином, полученный карбодиимидным методом. 4-недельных мышей линии Balb/c иммунизируют в течение месяца 3 раза по 30 мкг антигена. При первой инъекции раствор антигена суспендируют в равном объеме адьванта Фрейнда, последующие инъекции проводят без него. Титр антител в сыворотке крови животных, определяемый методом ELISA, составляет 3000, За 4 дня до слияния мышей иммунизируют раствором антигена в физиологическом растворе. Через 4 дня у мыши извлекают селезенку в стерильных условиях, гомогенизируют в физиологическом растворе, содержащем глюкозу (10%) и
ON СЛ Ю 4 VJ
оставляют стоять 3 мин. Грубый осадок отбрасывают, а взвесь клеток переносят в центрифужный стакан и центрифугируют 8 мин при 800 д. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок суспендируют в 50 мл физиологического раствора, содержащего глюкозу, снова центрифугируют в тех же условиях. Эту операцию повторяют 2 раза. Аналогичным образом промывают 3 раза физиологическим раствором мышиные мие- ломные клетки линии Sp 2/0. После этого селезеночные клетки смешивают с миелом- ными в соотношении 10:1 и осаждают их центрифугированием. Надосадочную жидкость сливают и к осадку медленно по каплям добавляют 1 мл 50%-ного гюлиэтиленгликоля в физиологическом растворе (содержание диметилсульфоксида 10%). Через 3 мин медленно в течение 5 мин добавляют физиологический раствор, содержащий глюкозу, до объема 50 мл. Клетки осаждают центрифугированием и осадок суспендируют в среде DM ЕМ, содержащей сыворотку крови оленей (10%), 3,5 мМ глю- тамина, 17,5 мкМ пирувата натрия, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 100 мкМ гипоксантина, 16 мкМ тимидина, 0,4 мкМ аминоптерина. Клетки распределяют в пяти 96-луночных микропланшетах и культивируют при 37°С в атмосфере 5% С02. Через 5 дней клетки подкармливают, убирая из каждой лунки 50 мкл среды и добавляя 50 мкл свежей.
Через 2 недели после слияния проводят тестирование гибридом на наличие моно- клональных антител методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, используя для сорбции на полистироловых микропланшетах конъюгат Pd-копропорфирина с соевым ингибитором трипсина. Клетки, положительные по результатам тестирования, помещают в среду, содержащую все указанные выше компо- нентыг за исключением аминоптерина (НТ- среда). Клетки наращивают в 24-луночных микропланшетах, часть из них замораживают, & остальные клонируют в полужидком агаре. Клонирование гибридомы повторяют трижды. Клонированную гибридому прививают мышам Balb/c с целью получения ас- цитной жидкости.
Полученный штамм гибридных клеток 5Д, 9G, 2F, синтезирующий моноклональ- ные антитела (монАТ) к Pd-копропорфири- ну, депонирован в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) № 356Д и характеризуется следующими свойствами.
Культуральные свойства. Для выращивания штамма используют культуральные флаконы Во флакон объемом 25 мл в 3 мл среды ДМ ЕМ, содержащей 10% фетальной
сыворотки, 3,5 мМ глютамина, 17,5 мкМ пирувата натрия, засевают 2,5 -105клеток гибридомы БД, 9G, 2F и проводят пассажи 1 раз в 4-5 дней с подсчетом клеток. Для получения асцита мышам Balb/c за 7 дней до введения гибридомных клеток вводят 0 5 мл 2,6 10,14-тетраметилпентадекана в/б. На 7 день штамм клеток инъецируют в/б в количестве 500000 клеток в мышь. Асцитную жидкость отбирают на 10-и день Объем асцита 5-6 мл. Клетки из асцита перевивают новым мышам в течение 9 пассажей без заметного изменения титра моноклональ- ных антител в асцит ной жидкости.
Контаминация, Бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Тест на микоплазму отрицателен.
Кариологическая характеристика штамма: модальное число хромосом 90. Маркерных хромосом не выявлено.
Продуктивность штамма. Концентрация
моиоклональных антител в культуральной жидкости на 7-й день культивирования составляет 100 мкг/мл, а в асцитной жидкости 10-12 мг/мл при определении методом Лури и методом твердофазного иммуноферментного анализа.
Криоконсервиоование Клетки штамма (500 тыс./мл) ресуспендируют в смеси, содержащей 30% эмбриональной телячьей
сыворотки, 10% диметилсульфоксида, 60% ДМ ЕМ, при 4°С, затем разливают в пластиковые ампулы и помещают в контейнеры из полиуретана. Контейнеры переносят в холодильник на -70°С HO 24 ч Затем клетки
переносят в жидкий азот на длительное хранение. Размораживание производится в водяной бане при 37°С. Жизнеспособность клеток 80%. .
Характеристика полезного продукта.
Моноклонзльные антитела относятся к IgG 1 подклассу иммуноглобулинов. Изоэлект- рическая точка по основной полосе соответ- ствуе 6,5.
Аффинную константу определяют следующим образом. В лунках 96-луночного микропланшета из полистирола иммобилизуют аффинно очищенные моноклональные антитела. К ним добавляют одновременно
различные концентрации копропорфирина 1 и постоянную концентрацию конъюгйта копропорфирина 1 с пероксидазой в ФБР Г. Конъюгат получают присоединением пор- фирина к белку с помощью 1-циклогексил-З- (2-моос)Олиноэтил)карбодиимида-п-70луолсульфоната. Реакционную смесь инкубируют 1 ч при 37°С, затем ее переносят в пробирки и оценивают количество не связавшегося с моноклинальными антителами копропорфирина 1 спектрофотометриче- ски.
Константа диссоциации равна 4,29 М.
Специфичность моноклональных антител оценивают методом твердофазного им- муноферментного анализа в следующей системе. Очищенные методом жидкостной хроматографии высокого давления моно- клональные антитела адсорбируют на поверхности полистирола. Затем к адсорбированным антителам добавляют изменяющиеся концентрации порфиринов и постоянную концентрацию Pd-копропорфи- рина 1, меченного пероксидазой (1,56- М) в ФБРТ. Различные порфирины растит- ровываютот , а белковые конъ- югаты порфирина от до М. В качестве контроля служат лунки с Pd (2+)- копропорфиринпероксидазой и буфером. Концентрации, при которых наблюдают 50% ингибирование, связывание конъюгата Pd (2+)-копропорфирин 1 - пероксидаза со свободным Pd (2+)-копропорфирином 1 и его производными оказались следующими, М:
,-9
1.Pd-копропорфирин - 4,2- Н)
2.Zn-копропорфирин - 4- 10
3.Копропорфирин 1-1,3 Юе
4.Копропорфирин 3 2,310
5.Цикло-Рс1-копропорфирин - 9,3 -10
,-5 -6 -5
,-6
6.Гематопорфирин IX не взаимодействует.
7.Pd-копропорфирин 1 - соевый ингибитор трипсина - 2 .
8.Pd-копропорфирин 1 - бычий сывороточный альбумин -1,4 .
Как видно из приведенных дачных, антитела с высоким сродством связываются со свободным Pd (2+)-копропорфирином. Замена атома Pd (2+) на атом Zn ухудшает связывание на 4 порядка, а с копропорфи- рином без металла связывание уменьшается более чем в 1000 раз. Моноклональные антитела чувствительны к природе боковых заместителей порфиринового кольца. Они совсем не взаимодействуют с природным гематопорфирином IX, что является их достоинством по сравнению с моноклональ- ными антителами ЗД, 9G, 2F (прототип), поскольку связываются с этим соединени
ем даже в том случае, если его содержание в исследуемом биологическом образце велико. Моноклональные антитела на 4 поряд- 5 ка хуже взаимодействуют с природным копропорфирином 3, т.е. на порядок хуже, чем Моноклональные антитела гибридомы ЗД, 6Е, 2G. Они на полтора порядка хуже взаимодействуют с цикло-Рй-копропорфи10 рином, чем Моноклональные антитела ЗД, 9G, 2F. Таким образом, Моноклональные антитела заявляемой гибридомы более специфичны по отношению к копропорфирину 1, чем гибридомы прототипа. Это позволяет
15 уменьшить перекрестные реакции при проведении иммунологических анализов,
Пример. Применение Pd-копропор- фирина в паре с монАТ БД. 91, 2F в качестве проявляющего реагента в иммунофосфо20 ресцентном анализе на инсулин.
В методике используют также монАТ к инсулину в твердофазном конкурентном варианте иммуноанализа.
Смесь монАТ к инсулину (6 10 М) с
25 различными концентрациями инсулина (1,7510 М) инкубируют в лунках микропланшета с предварительно адсорбированным инсулином в течение 1 ч при 37°С в ФБРТ. В качестве контроля служит микро30 планшет, на поверхности которого адсорбирован бычий сывороточный альбумин. . Затем планшеты отмывают ФБРТ и инкубируют в течение 1 ч с кроличьими антимышиными антителами (6 10 М) и насыщающей
35 концентрацией комплекса Моноклональные антитела - Pd (2+)-копропорфирин 1. После отмывания сорбированного на полистироле комплекса проводят его десорбцию и измерение фосфоресценции.
40Результаты показывают, что минимальная концентрация инсулина, определяемая в данной схеме, приблизительно равна 5х
М.
Минимальная концентрация инсулина, определяемая с помощью иммуноперокси- дазного ПАП метода, соответствует 1-10 М при одинаковых условиях проведения анализа, т.е. монАТ 5Д. 9G. 2F позволяют повысить чувствительность определения на полпорядка.
Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus L. ВСКК(п) № 356Д-Продуцент моноклональных антител к Pd-кoпpoпopфиpинy-1.
Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в качестве парного проявляющего реагента в иммунофосфоресцентных методах анализа различных антигенных веществ. Цель изобретения - получение штамма гибридомы, продуцирующего моноклональные антитела (монАТ) более высокой специфичности и с более высоким выходом. Штамм получают гибридизацией клеток селезенки мышей Balb/c, иммунизированных коньюгатом Pd- копропорфирин 1 - альбумин с клетками мышиной миеломы Sp 2/0 - Ад 14. Штамм культивируют в среде ДМЕМ с 10% сыворотки эмбриона коровы, а также in vivo в брюшной полости сингенных мышей. Содержание монАТ в культуральной жидкости на 7-е сут. 100мкг/мл, в асцитной жидкости 10 мг/мл. Секретируемые клетками штамма монАТ класса IgG 1 обладают высокой аффинностью (Kd 4,6 М) по отношению к Pd-копропорфирину 1, а также высокой специфичностью в отношении его связывания. Они на несколько порядков слабее взаимодействуют с другими природными порфири- нами, что дает возможность использовать их в иммунофосфоресцентном анализе в модификации порфирин - антипорфирин. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) № 356Д. tmf fe
| Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый для получения моноклональных антител к Р @ -копропорфирину | 1988 |
|
SU1562353A1 |
| Способ гальванического снятия позолоты с серебряных изделий без заметного изменения их формы | 1923 |
|
SU12A1 |
