Способ очистки трипсина Советский патент 1992 года по МПК C12N9/76 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения про- теолитических ферментов из сырья животного происхождения, и может быть использовано в фармацевтической и пищевой промышленности, в медицинской и научно-лабораторной практике.

Среди известных методов очистки про- теолитических ферментов наиболее прогрессивным является метод аффинной хроматографии, основанный на сродстве ферментов к специфическим аналогам субстрата или ингибиторам, ковалентно связанным с нерастворимым носителем, что позволяет разделять ферменты на основе их биологической специфичности.

Известен способ очистки трипсина из экстракта пилорических придатков лососевых рыб на сорбенте 1,6-диаминогексан - полимер - бумага, Сорбцию в этом случае осуществляют в буферной смеси 0,05 - 0,07 М трис-HCt, содержащей 0,05 - 0,1 М №CI

при рН 7,8 - 8,0, промывку проводят последовательно указанной смесью и 0,03 - 0,05 М раствором глицина при рН 10,3 - 10,6, а десорбцию 0,05 - 0,2 М раствором лизина при рН 10,4- 10,6.

Выход трипсина по активности составляет всего 24-27% от исходной, а удельная активность увеличивается по сравнению с исходной в 4 раза. Сорбционная емкость также довольно низкая и составляет 1,2 мг фермента на 1 г сорбента.

Наиболее близким к предлагаемому является способ очистки трипсина на сорбенте 1,6-диаминогексан - целлюлоза из экстракта пилорических придатков лососевых рыб. Этот способ очистки включает следующие операции.

Экстракция 0,01 М фосфатным буфером рН 6,0 - 6,2, а затем аффинная хроматография на сорбенте 1,6-диаминогексан-целлю- лоза путем сорбции в 0,01 М фосфатном буфере (рН 6,0 - 6,2) и десорбции целевого

(Л

с

ч| Јь Ю 00 Ю

ю

продукта 30%-ным изопропиловым спиртом, содержащим 1,0-1,5% NaCI. Выход по общей активности 84,5 - 90%, удельная активность повышается в 10-12 раз по сравнению с исходной.5

Недостатком известного метода является низкая сорбционная емкость сорбента (1,0 мг/г), что отрицательно сказывается на производительности способа.

Целью изобретения является повыше- 10 ние производительности способа путем увеличения сорбционной емкости сорбента.

Для достижения цели согласно способу очистки трипсина из экстракта пилориче- ских придатков лососевых рыб путем хрома- 15 тографии на биоспецифическом сорбенте - 1,6-диаминогексан-носитель с последующей элюцией целевого продукта в качестве сорбента используют аргинин-1,6-диамино- гексан-сферон,или е-аминокапроновая-1,6- 20 иаминогексансферон, а элюцию целевого продукта проводят раствором 1,3 - 1,5 М хлорида натрия в 30%-ном изопропиловом спирте,

Существенным отличием предлагаемо- 25 го способа по сравнению с известными является использование новых сорбентов: Ј аминокапроновая кислота - 1,6 -диамино- гексан-сферон и 1 -аргинин-1.6-диаминогек- сан-сферон. Новые лиганды - аргинин, 30 являющийся специфическим субстратом трипсина, и е -аминокапроновая кислота (аналог специфического субстрата лизина) наряду со спейсером - 1,6-диаминогекса- ном обеспечивают достижение нового ре- 35 зультата - десятикратное увеличение сорбционной емкости по сравнению с существующими аналогами при сохранении достаточно высокого увеличения удельной активности. Сорбционная емкость сорбента 40 Ьаргинин-1,6-диаминогексан составляет 8 мг на 1 г сорбента, а сорбента - е -аминокапроновая кислота - 1,6-диаминогексан- сферон - 12 мг/г , При этом выход целевого продукта в обоих случаях составляет 100% 45 от сорбированного материала, а увеличение удельной активности по сравнению с исходной в 10-12 раз в случае сорбента е -аминокапроноваякислота1,6-диаминогексан-сферон ив 16-17 раз в 50 случае сорбента Ьаргинин-1,б-диаминогек- сан-сферон.

Пример 1. Синтез сорбента L-арги- нин-1,6-диаминогексан-сферон.

5 г сферона, промытого тщательно во- 55 дои и отфильтрованного на стеклянном фильтре, смешивают с 17 мл гидразингид- рата и нагревают на водяной бане 1,5 ч, затем переносят на стеклянный фильтр и

промывают 1,5л воды. К хорошо промытому сорбенту приливают 150 мл 2 н. раствора соляной кислоты, охлаждают во льду до 3°С и приливают охлажденный до 3°С 120 мл 2%-ного раствора NaN02 (нитрита натрия). Через 20 мин отмывают носитель 1 л холодной воды и переносят в охлажденный раствор 1,6-диаминогексана (9 г 1,6-диаминогексана в 50 мл воды). На следующий день осуществляют перемешивание еще в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем отмывают сорбент водой на стеклянном фильтре и помещают в 1%-ный раствор трис-оксим етиламинометана на 2 ч при комнатной температуре при перемешивании на магнитной мешалке для забивки остаточных-аминных групп. Полученный сорбент промывают водой, спиртом и сушат на воздухе. 5 г L-аргинина-гидрохлорида растворяют в 50 мл воды, концентрированной соляной кислотой рН доводят до значения 4,8 и добавляют к этому раствору 5 г сорбента.

К полученной смеси при постоянном перемешивании в течение 10 мин по каплям приливают спиртовый раствор дициклогек- силкарбодиимида (С 0,5 г/мл) в количестве 5 г и промывают последовательно: 100 мл спирта, 50 мл спирта + 50 мл воды, 250 мл спирта, 50 мл спирта + 50 мл воды, 50 мл 0,001 н. раствора соляной кислоты, 50 мл воды, 50 мл 0,1 н. NaHCOa и 100 мл воды. После промывки носитель суспендируют в 10 мл 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,8).

П р и м е р 2. Синтез сорбента е -аминокапроновая кислота-1,6-диаминогексан- сферон.

5 г сферона промывают тщательно водой, отфильтровывают на стеклянном фильтре и смешивают с 17 мл гидразингидрата. Нагревают на водяной бане 1,5 ч, затем пе- реносятна стеклянный фильтр и промывают 1,5 л воды. К хорошо промытому сорбенту приливают 150 мл 2 н. раствора соляной кислоты, охлаждают во льду до 3°С и приливают 120 мл 2%-ного раствора нитрита натрия, охлажденного до 3°С. Через 20 мин отмывают носитель 1 л холодной воды и переносят в охлажденный раствор 1,6-диаминогексана (9 г 1,6-диаминогексана в 50 мл воды). На следующий день осуществляют перемешивание еще 2 ч при комнатной температуре. Затем отмывают водой на стеклянном фильтре и помещают в 1%-ный раствор трис-оксиметиламинометана на 2 ч при комнатной температуре при перемешивании на магнитной мешалке для забивки остаточных аминогрупп. Полученный сорбент промывают водой, спиртом, сушат на

воздухе, 5 г в -аминокапроновой кислоты растворяют в 50 мл воды. Концентрированной соляной кислотой рН доводят до значения 4,8 и добавляют к этому раствору 5 г сорбента.

К полученной смеси при постоянном перемешивании в течение 10 мин по каплям приливают спиртовый раствор дициклогек- силкарбодиимида (С 0,5 г/мл) в количестве 5 г и промывают последовательно: 100 мг спирта, 50 мл спирта + 50 мл НаО, 250 мл спирта, 50 мл спирта + 50 мл Н20, 50 мл 0,001 н. раствора соляной кислоты, 50 мл воды, 50 мл 0.1 н. МаНСОз, 100 мл воды. После промывки носитель суспендируют в 10 мл 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,8).

Пример 3, Получение экстракта.

Навеску лиофильно высушенных пило- рических придатков лососевых гомогенизируют дважды на микроизмельчителе тканей РТ-2 (или иной марки) со скоростью 5 тыс. об/мин до получения однородной массы при 4°С. К гомогенату прибавляют три объема охлажденной дистиллированной воды, перемешивают и оставляют на холоде на ночь, после чего центрифугируют на центрифуге со скоростью 6000 об/мин при 2°С. Содержание белка определяют спектрофо- тометрическим методом.

Пример 4. На колонку, заполненную 2 мл сорбента 1 -аргинин-1,6-диаминогек- сан-сферон, уравновешенную 0,05 М фосфатным буфером (рН 7,8), наносят 200 мл водного экстракта сублимированных лило- рических придатков лососевых. Эстеразная активность исходного препарата 20 ед/мг белка (субстрат БАЭЭ-бензоил-1 -аргинил- этиловый эфир) - трипсинподобная активность 113 ед/мл белка (субстрат БТМЭ - бензоил-1 -тирозин-метиловый эфир) - хи- мотрипсинподобная активность. Промывку колонки осуществляют 0,05 М фосфатным буфером (рН 7,8), содержащим 0,1 М хлористого натрия. Десорбцию целевого продукта осуществляют 30%-ным изопропиловым спиртом, содержащим 1,5 М NaCI.

Сорбционная емкость колонки составляет 8,2 мг/г сорбента, выход целевого продукта от сорбируемого 100%, удельная активность (субстрат БАЭЭ) - 357 ед/мл, что в 17 раз выше по сравнению с исходной активностью. В конечном продукте не обнаружена примесь химотрипсина.

Пример 5. На колонку, заполненную 2 мл сорбента Ј -аминокапроновая кислота - 1,6-диаминогексан-сферон, уравновешенную 0,05 М фосфатным буфером (рН 7,8) наносят 30 мл водного экстракта протеоли- тического комплекса пилорических придатков лососевых. Эстеразная активность исходного препарата 123 ед/мг белка (субстрат БАЭЭ)-трипсинподобная активность и 315 ед/мг белка (субстрат БТМЭ) - химотрипсинподобная активность. Промывку колонки осуществляют 0,05 М фосфатным буфером (рН 7,8), содержащим 0,1 М NaCI. Десорбцию целевого продукта осуществляют 30%-ным изопропиловым спиртом, содержащим 1,3 М NaCI. Сорбционная емкость колонки составляет 12 мг/r носителя. Выход целевого продукта от сорбированного 100%. Удельная активность (субстрат БАЭЭ) - 1438 ед/мг белка, что в 12

раз выше по сравнению с исходной активностью. В конечном продукте не обнаружена примесь химотрипсина. Определение эстеразной активности проводят по методу Шверта и Такенаки.

К 3 мл 0,0005 М субстрата (БАЭЭ или

БТМЭ) прибавляют 0,2 мл ферментного раствора, содержащего от 20 до 50 мкг белка. Измеряют экстинкцию поглощения на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 247

нм (для БАЭЭ) или 253 нм (для БТМЭ) пробы (инкубация 5 мин) против контроля (эта же смесь Т 0 мин). Реакцию проводят при 25°С.

Расчет удельной активности фермента

проводят по формуле:

Ауд

Луд 5 0,001 -а где Е - разница между значениями экстинкций, измеренных при длине волны 247 или 253 нм в момент начала реакции и в момент окончания реакции; 5 - время реакции, мин; а - количество белка в исследуемой пробе, мг.

Сопоставление известных способов

очистки трипсина из экстракта пилорических придатков лососевых показывает преимущества предлагаемого способа, которые заключаются в значительном увеличении

сорбционной емкости предлагаемых сорбентов: в случае сорбента 1 -аргинин-1,6-ди- аминогексан-сферон увеличение в 7 - 8 раз.

50

Формула изобретения

Способ очистки трипсина из экстракта пилорических придатков лососевых рыб, включающий хроматографию экстракта на носителе, содержащем 1,6-диаминогекса- 5 новые группы с последующей элюцией целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения производительности способа путем увеличения сорбционной емкости сорбента, в качестве сорбента используют L-зргинин- ,6-диаминогексан-сферон

или Ј -аминокапроил-1,б-диаминогексан- раствором 1,3 - 1,5 М NaCI в 30%-ном изо- сферон, а элюцию целевого продукта проводят пропиловом спирте.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения протеолитических ферментов из сырья животного происхождения, и может быть использовано в фармацевтической и пищевой промышленности, в медицинской и научно-лабораторной практике. Цель изобретения - повышение производительности способа путем увеличения сорбционной емкости сорбента. Для этого в качестве сорбента используют JL -аргинин-1,6-диаминогексан-сферон или Ј - аминокапроил-1,6-диаминогексан-сферон, а злюцию целевого продукта проводят раствором 1,3-1.5 М NaCI вЗО%-ном изопропиловом спирте. Сорбционная емкость носителей составляет 8- 12 мг/г сорбента, степень очистки фермента 10-18 раз.