Способ очистки @ I-раково-эмбрионального антигена Советский патент 1991 года по МПК G01N33/531 

Изобретение относится к биохимии и медицине, конкретно к очистке меченного йодом-125 ракопо-эмбрионального антигена ( 1-РЭА) который может быть использован в качестве компонента радиодиагностических наборов для определения РЭА в сыворотке крови человека

Целью изобретения является упрощение способа очистки JI-P3A за счет исключения этапа гель-хроматографии

Проводят иммуноаффинную хроматографию непосредственно из реакционной смеси моноклональными антителами (монАТ) к РЭА, иммобилизованных на CNBr агарозе, исключают этап гель-хроматографии. Особенностью предлагаемого способа является проведение иммуноэффинной хроматографии на монАТ к РЭА, например, продуцируемых штаммов гибридных клеток С1.В8.С7.3 Nb ВСКК/П/46Д.

Способ осуществляют следующим образом.

МонАТ выделяют из аг.цитнои жидкости мышеи BALB/c, которым пересажены гибридные клетки фракционированием сульфатом аммония и ионообменной хроматографией на колодке Mono QHR 5/5 с помощью системы высокоскоростной белковой жидкостной хроматографии FPLC фирмы Pharmacia (Швеция) Иммуносорбент МонАТ к РЭА-агароза получают иммобилизуя монАТ на CNBr-агарозе (отечественный аналог CNBr-сефарозы фирмы Pharmacia) в условиях, рекомендуемых фирмой Pharmacia при концентрации монАТ 1мг на 1 мг геля. Емкость иммуносорбента составляет 0.3 мг РЭА на 1 мг геля

Реакционную смесь, содержащую РЭА. наносят на колонку с иммуносорбентом, после промывки элюцию антигена ведут 0,1 М глицин-HCI при рН 2,2

Пример 1 РЭА радиойодируют с помощью хлорамин Т-метода. Радиохимический выход составляет 25-30% Реакцией(Л

С

10

о со

о

-.

оо

ную смесь наносят на колонку (0.5x2 см) с иммуносорбентом моноАТ к РЭА-агароза. Колонку промывают со скоростью 15 мл/ч последовательно 20 мл 0,05 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,4, содержащем 0,1 М NaCI; Ю мл 0,05 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,4, содержащего 0,3% холат натрия и 1 М NaCI, 10 мл 0,05 М натрий фосфатного буфера, рН 7,4. Элюируют 1-РЭА с имму- носорбента 0,1 М глицин-HCI, рН 2,2. Элюат собирают по 1 мл в пробирки, содержащие по 1 мл 0,2 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,4, содержащего 2% БСА и 0,05% NaNg.

Иммунореактивность препарата I- РЭА составляет 92% (иммунореактивность определяют с избытком кроличьей антисыворотки к РЭА с системой разделения - сульфат аммония), неспецифическое связывание составляет 0,8% (неспецифическое связывание определяют при отсутствии антисыворотки к РЭА с системой разделения - вторые антитела, иммобилизованные на микрокристаллической целлюлозе). Через 40 сут иммунореактивность меченого антигена составляет 71%, а неспецифическое связывание - 3,4%.

Пример 2. РЭА радиойодируют с помощью хлорамин Т- или лактоперокси- дазного метода. Для очистки 1-РЭА из реакционной смеси используют иммуно- сорбент, а условия элюирования по примеру 1.

Для промывки иммуносорбента используют следующие буферные системы: 0,05 М натрий-фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 1 М NaCI (а); 0,05 М натрий-Фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,1-0.5 Твин-20 и 1 М NaCI (б); 0,05 М натрий-фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,1-0,5% тритон- Х-100 и 1 М NaCI (в); 0,05 М натрий-фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,025-0,05% додецилсульфат натрия и 1 М NaCI (г). Остальные условия промывки по примеру 1.

0

5

0

5

Иммунореактивность 1251-РЭА после очистки с промывкой иммуносорбента по а составляет 73-77%, неспецифическое связывание - 4,0-5,6%: через 40 сут иммунореактивность составляет 50-56%, неспецифическое связывание - 5,5-6,1%.

Иммунореактивность 1-РЭА после очистки с промывкой иммуносорбента по б составляет 76-83%, неспецифическое связывание - 4,4-5.2%; через 40 сут иммунореактивность составляет 55-62%, неспецифическое связывание - 5,0-5,7%.

Предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет упростить процесс очистки 1251-РЭА за счет сокращения на одну стадию - не проводится гель-хроматография реакционной смеси на сефадексеС-200. Общее время процесса очистки сокращается на 3 ч, т.е. приблизительно в два раза. Способ гарантирует получение при использовании разных методов радиойодирования (хлорамин Т-метод, ферментативный метод) высокоиммунореактивных, стабильных препаратов 1 с хорошей воспроизводимостью, что делает возможным серийный выпуск радиодиагностических наборов для определения РЭА в сыворотке крови человека.

Формула изобрет Способ очистки 1-рг

е н и я

раково-эмбрио- нального антигена, включающий добавление опухолевого экстракта в колонку, содержащую сорбент, сенсибилизированный антителами к раково-эмбриональному антигену, промывание иммуносорбента и элюцию антигена, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа за счет исключения этапа гель-хроматографии, иммуносорбент сенсибилизируют моноклональ- ными антителами к раково-эмбриональному антигену штамма гибридомы С1.В8.С7.3 № ВСКК(М)46Д.

Изобретение относится к биохимии и медицине, а конкретно к методам очистки раково-эмбрионального антигена (РЭА), и может быть использовано в качестве компонента иммунной тест-системы для определения РЭА в сыворотке крови человека. Целью изобретения -является упрощение способа очистки ¹²⁵J РЭА. Поставленная цель достигается исключением этапа гель-хроматографии опухолевого экстракта и использованием для сенсибилизации иммуносорбента моноклональных антител к РЭА штамма гидродомы С1.В8.С7.3 N ВСКК (П)46 Д.