Способ определения адреналина в биологическом материале Советский патент 1991 года по МПК G01N33/84 

сл

с

Изобретение относится к физико-химическим методам анализа, в частности к по- тенциометрическому определению микроколичеств адреналина в биологических средах. Цель изобретения - повышение чувствительности и ускорение способа. Способ заключается в том, что в исходную пробу добавляют серотонин в конечной концентрации б КГ -б-КГ5 М, дезаминируют при помощи биоспецифического катализатора с моноаминоксидазной активностью и измеряют скорость дезаминирования серо- тонина в присутствии добавок адреналина. По скорости дезаминирования расчетным путем определяют концентрацию адреналина в исходной пробе. Изобретение позволяет в течение 40-60 мин провести определение адреналина в биопробе, минимальное определяемое количество адреналина моль/л. 1 табл.

Изобретение относится к области физико-химических методов анализа, в частности к потенциометрическому определению микроколичеств адреналина в биологических средах и в других растворах, и может быть использовано в медицине и фармакологии.

Цель изобретения - повышение чувствительности и ускорение способа.

Способ осуществляется следующим образом.

К биоспецифическому катализатору с моноаминоксидазной (МАО) активностью добавляет сыворотку крови, боратный буфер, рН 7,6, и раствор серотонина в конечной концентрации 5-10 -5-КГ5 М, через измерительный сосуд в условиях термоста- тирования пропускают кислород, затем по- тенциометрически определяют выделение

аминопроизводных, фиксируя время падения потенциала на 0,3 ед. рН. Расчет количества адреналина проводят по формуле

()tx+2atx

)-1-2.(

tx+2a tx

-О

tx +a tx

-0-(

tx+2a tx

-o

где l(x) - количество адреналина в биологическом материале, моль/л,

tx - время падения потенциала на 0,3 ед. рН в пробе без добавки адреналина, с;

а - фиксированное количество адреналина;

tx+a - время падения потенциала на 0.3 ед. рН в пробе с добавкой а моль/л чдрена- лина, с;

О

00

ю

Оч 00

tx+2a - время падения потенциала на 0,3 ед. рН в пробе с добавкой 2а моль/л адреналина, с.

П р и м е р 1. Определение сыворотки в крови.

Проба 1-я. 0,5 г биоспецифического катализатора с моноаминоксидазной (МАО) активностью помещают между мембранами ячейки и промывают 0,01 М боратным буфером (рН 7,6) и бидистиллированной водой. Ячейку помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют туда же анализируемую пробу - 1 мл сыворотки крови и 2 мл 0,1 М боратного буфера (рН 9,0). Измерительный сосуд закрывают, помещают в термостат при 45°С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают 02 без С02. Далее поток 02 перекрывают,до- бавляют в реакционную среду 1 мл 1-10 М раствора серотонина (концентрация в пробе 2, М). Сосуд герметически закрывают, включают мешалку и измеряют время падения потенциала на 0,3 ед. рН (tx 380 с).

Продолжительность анализа 20 мин.

Проба 2-я, Анализируемую пробу подготавливают следующим образом.

0,5 г биоспецифического катализатора с МАО активностью, подготовленную аналогично пробе 1-й, помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют туда же анализируемую пробу - 1 мл сыворотки крови, 1,8 мл 0,1 М боратного буфера (рН 9,0) и 0,2 мл М раствора адреналина {стандартная добавка а М). Далее выполняют все операции аналогично пробе 1-й.

Время падения потенциала на 0,3 ед. рН 496 с (tx+a 496 с).

Продолжительность анализа 22 мин.

Проба 3-я. Выполняется аналогично пробе 2, но стандартная добавка адреналина -0,2 мл 2-10 М раствора адреналина ( М в пробе). Время падения потенциала на 0,3 ед. рН равно 571 с (tx+2a 571 с).

Продолжительность анализа 26 мин.

Из данных, получаемых при анализе проб 1-, 2- и 3-й, определяют концентрацию адреналина:

tx 380 (найдено в пробе 1)

tx+a ° 496 (найдено в пробе 2)

tx+2a 571 (найдено в пробе 3)

а - М (добавлено адреналина в

пробе 2)

2а ЫО М (добавлено адреналина в

пробе 3)

Согласно формулам

. tx+a ,

ь, -- -1 .

,

находят

,3;

02 Цо- ,5

,с Согласно формуле 1(х) -2,

5- 10

0,5-1 10

0,3

0,3 - 0,5

0

5

0

5

0

5

находят концентрацию адреналина в сыворотке крови:

12 2,,

П р и м е р 2. Определение адреналина в экстракте сердца морской свинки.

Проба 1-я. 0,06 г препарата с МАО активностью (2), помещают между мембранами ячейки и промывают 0,01 М фосфатным буфером (рН 7,6) и бидистиллированной водой. Ячейку помещают в сосуд для измерения электрода с газовым зазором, добавляют туда же анализируемую пробу - 1 мл экстракта сердца морской свинки. Добавляют 2 мл 0,1 М боратного буфера (рН 9,0). Измерительный сосуд закрывают, помещают в термостат при 45°С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают 02 без С02. Далее поток перекрывают, добавляют в реакционную среду 1 мл М раствора серотонина (концентрация в пробе М). Сосуд герметически закрывают, включают мешалку и измеряют время падения потенциала на 0,3 ед. рН (tx 760 с).

Продолжительность анализа 29 мин.

Проба 2-я. Анализируемую пробу подготавливают следующим образом.

0,06 г препарата с МАО активностью помещают в сосуд для измерения электрода с газовым зазором, добавляют анализируемую пробу- 1 мл экстракта сердца морской свинки, 1,8 мл 0,1 М боратного буфера (рН 9,0) и 0,2 мл М раствора адреналина (стандартная добавка а ). Далее выполняют все операции аналогично пробе 1-й.

Время падения потенциала на 0,3 ед. рН tx+a 1400с.

Продолжительность анализа 37 мин.

Проба 3-я. Выполняется аналогично пробе 2, но стандартная добавка адреналина - 0,2 мл 8«10 раствора адреналина; 2а 4 10 5M;tx+2a 1932c.

Продолжительность анализа 45 мин.

Из данных, полученных при анализе проб 1-, 2- и 3-й, определяют содержание адреналина:

- 1400 1 ТбТ 1

1QOO

1 0,84;Ь2 Ј -1 1,54;

760

., 10 S 1,54 -4 10 5 0,84 |(Х)0,84-1,54

4 10 МОЛ1/Л

П р и м е р 3. Определение адреналина в крови.

Проба 1-я. 0,5 г препарата с МАО активностью (1) подготавливают аналогично пробе 1-й примера 1. В сосуд для измерений электрода с газовым зазором добавляют анализируемую пробу - 1 мл крови, туда же добавляют 2 мл 0,1 М боратного буфера (рН 9,0). Измерительный сосуд закрывают, помещают в термостат при 45°С, включают магнитную мешалку и ЮминпропускаютОа без С02. Далее поток 02 перекрывают,ло- бавляют в реакционную сферу 1 мл М серотонина (концентрация в пробе М). Сосуд герметически закрывают, включают мешалку и измеряют время падения потенциала на 0,3 ед. рН tx 360 с.

Продолжительность анализа 18 мин.

Проба 2-я. Выполняется аналогично пробе 1-й. В сосуд для измерения добавляют 1 мл крови. 18 мл 0,1 М боратного буфера (рН 9,0) и 0,2 мл М раствора адреналина (концентрация стандартной добавки) а М). Далее все выполняют аналогично пробе 1-й.

Время падения потенциала на 0,3 ед. рН равно 470 с.

Продолжительность анализа 23 мин.

Проба 3-я. Выполняется аналогично пробе 2, но стандартная добавка адреналина - 0,2 мл М-раствора адреналина; .10 5M;tx+2a 543c.

Продолжительность анализа 25 мин.

Из данных, полученных при анализе проб 1-, 2- и 3-й, определяют содержание адреналина:

tx+a 470 с; tx+2a 543 с;

470 360

- 1 0,3 ; 02

543 360

1 0,5;

а 5.106 М; 2а-1-10 5 М;

l(x)

5 10

-6

0,5 -1 10

0,3

0,3 -0,5

2,5- 10 М

В таблице представлены данные определения содержания адреналина в различных биологических материалах предложенным и известным способами.

Продолжительйость определения предложенным способом 40-60 мин.

Продолжительность определения по способу-прототипу 2,5-3 ч (продолжительность инкубации, полное дезаминирование,

установление постоянного потенциала).

Приведенные примеры показывают хорошее совпадение результатов, полученных предложенным и известным способам. В случае концентраций ниже М известным способом адреналин не определяется, поскольку чувствительность метода недостаточна.

Чувствительность предложенного способа повышается на три порядка, минимальная определяемая концентрация моль/л.

Формула изобретения Способ определения адреналина в биологическом материале путем дезаминиро- вания моноамина при помощи биоспецифического катализатора с моно- аминоксидазной активностью и последующей потенциометрической регистрации

эминолроизводных, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и ускорения способа, в исследуемые пробы дополнительно вводят серотонин и концентрации 5 10 М, регистрируют выделение аммиака в пробах, содержащих биологический материал, и фиксированное количество адреналина, а расчет проводят по формуле

5

()Ч+2аtx

)-1-2а(

tx +2a tx

О

tx+2 tx

-1)-(

tx

-О

где 1(х) - количество адреналина в биологи ческом материале, моль/л;

tx - время падения потенциала на 0.3 ед. рН в пробе без добавки адреналина, с;

время падения потенциала на 0,3 ед. рН в пробе с добавкой а моль/л адреналина, с;

tx+2a - время падения потенциала на 0,3

а - фиксированное количество адрена- 5 ед. рН в пробе с добавкой 2а моль/л адрелина;

время падения потенциала на 0,3 ед. рН в пробе с добавкой а моль/л адреналина, с;

tx+2a - время падения потенциала на 0,3

налина, с.