Способ определения биогенных моноаминов Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 

128200

бу крови. Сосуд 1 закрывают, помещают Б термостат, включают магнитную мешалку и пропускают кислород. Затем поток кислорода перекрывают и в закрытом сосуде производят перемешивание. После инкубации ячейку 8 вынимают. В сосуд добавляют хлористый калий. Сосуд охлаждают, закрывают пробкой 3 со стеклянным электродом 4. Снова пропускают кислород и через

1

Изобретенме о:гносится к физико- химическим методам анализа, в частности к потепциометрическому определению №-1кроколичеств моноаминов в биологических средах, и может быть использовано в медицине и фармакологии , 1

Способ позволяет определить сумMap iioe количество биогенных моноами- НО73 (ссрототгипа, бензиламина, тирами иа, триптамина, порадреналина и дру- rifx мопоаминов, кроме адреналина), а также селективно определять серо- тонин и бепзиланип в смеси моноаминов,

И.ел П; изобретения - повышение чувсвительности способа, селективное определение серотонина и бензиламина за счет использования биоспецифического катализатора с моноамино- ксидазной активностью и селективных ингиби,горов дезамш-птровапня моно- аминов,

На фиг„ 1-3 показано устройство для определения моноаминов.

Устройство для определения количества моноаминои в биологических средах содержит стеклянный сосуд 1 со. шлифом Собьем сосуда 17,7 мл),

Сосуд герметично закрывают стеклян

ной трубкой со шлифом 2, в трубку вставляется резиновая пробка 3 со стеклянным рН-электродом. 4, электролитическим мостиком 5 и иглами-ка- пи-плярами 6, Конец электролитическо) го мостика 5 выведен на чувствительную поверхность рН-электрода 4. Для большей надежности, герметичности резиновую пробку 3 заливают герметизирующим слоем парафина. Иглы-капилляры б используют для добавления некапилляр 6 вводят в смесь едкий натрий. После установления постоянного значения потенгщала на электроде записывагот показания потенциометра. По градуированной прямой находят значение концентрации моноаминов. В присутствии ацеклидина полученное значение соответствует сумме концентраций тирамина и бензиламина. 2 з.п. ф-лы, 3 ил.

обходимых компонентов в реакционную смесь 7 (объемом 4 мл) и пропускания кислорода через газовый зазор. В стеклянный сосуд 1 помещают ячейку 8

с биоспецифическим катализатором с моноаминоксидазной активностью.

Ячейка 8 (фиг.2 и 3) содерл ит два кольца 9 и 10, прилегающих друг к другу и скрепленных полупроницаемой

мембраной. В одном из колец вмонтирован магнитик 11 для магнитной мешалки.

Способ осуществляется следующим образом.

0,5 г биоспецифического катализатора с моноаминоксидазной (МАО) активностью помещают на мембрану ячейки 8 и промывают 0,01 М раствором боратного буфера (рН 7,6) и бидистиллированной водой. Ячейку 8 помещают в сосуд 1 для измерений электрода с газовым зазором, добавляют туда 2 мл 0,1 М боратного буфера рН 7,6, 1 мл -воды или раствор обратимого ингибитора и 1 мл исследуемого раствора биогенных моноаминов: серотонина, тирамина.., бензиламина или пробу кро-, ви. Измерительный сосуд 1 закрывают, помещаЕОт в термостат при 35-45°С,

включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают О без СО. Далее поток О 2 перекрывают и герметически закрытый сосуд 1 выдерживают не менее 50 мин при 35-45°С и интенсивном перемеш1 вании. После инкубации ячейку 8 с МАО вынимают, в сосуд 1 добавляют 1-,4 г КС1, охлаждают сосуд. 1 до 25°С, закрывают пробкой 3 со стеклянным рП-электродом 4, на поверхность которог о помеп.ена капля 0,2%-ного раст- вора тритона Х-305 в бидистиллированной воде, снова пропускают О без СО и затем через капилляр 6 вводят в реакционную смесь 0,2 кп 1 М NaOH (рН раствора 12) для полного высвобождения NH . После установления

3

постоянного значения потенциала (рН) , т.е. через 20 мин, на электроде записывают показания потенциометра (рН-метра). Находят по градуировочной прямой значение концентрации мо- fO крови.

ноаминов, соответствующее значению потенциала, В присутствии (2,) 10 М ацеклидина полученное значение соответствует сумме концентраций тирами- на и бензиламина при концентрации ацеклидина и метацина () 10 м соответствует концентрации бензил- амина. Чувствительность способа .

Пример 1. 0,5 г биоспецифического катализатора с МАО-актив- ностью помещают мелоду мембранами ячейки 8 и промывают 0,01 М раствором боратного буфера (рН 7,6) и би- 25 дистиллированной водой. Ячейку 8 помещают в сосуд 1 для измерений электрода с газовым зазором, добавляют туда 3 мл 0,15 М раствора КС1 или NaCl и 0,5 мл исследуемой крови че- 30 ловека. Измерительный закрывают, помещают в термостат при 35°С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают О без СО. Далее поток

20 растворе КС1 (1:1), 1,7 мл К-фосфатного буфера рН 7,6, 0,32 мл5 10 М раствора серотонина, 0,24 мл 5-10 М раствора тирамина и 0,24 мл 5- 10 М раствора бензиламина. Таким образом, концентрации в реакционной смеси серотонина 4-10 М, триамина 3-10 М, бензиламина З Ю м. Общая концентра ;дия моноаминов в реакционной смеси .Измерительный сосуд закрывают, помещают в термостат при 45°С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают 0 без СО2. Далее поток 0,2

перекрывают и герметически закрытьш Ог перекрывают и герметически закры- 35 сосуд 1 выдерживают 50 мин при 45.° С тый сосуд 1 вьщерживают 60 M-IH при 35 С с интенсивным перемешиванием. После инкубации ячейку 8 с МАО вынимают, в сосуд 1 добавляют 1,4 г КС1, охлаждают сосуд до , закрывают 40 пробкой 3 со стеклянным рН-электро- дом 4, на поверхность которого помещена капля 0,2%-ного раствора тритона Х-305 в бидистиллированной воде,

45 I

ПримерЗ. 0,5г биоспецифического катализатора с МАО-актив- ностью помещают между мембранами ячейки 8 и промывают 0,01 М раство- 50 ром боратного буфера (рН 7,6) и бидистиллированной водой. Ячейку 8 помещают в сосуд 1 для измерений с газовым зазором, добавляют туда 1 мл

снова пропускают О без СО и затем через капилляр вводят в реакционную смесь 0,2 мл 1 М NaOH (рН растворам ,12) для полного освобождения NH . После установления постоянного потенциала (рН), т.е. через 20 мин на электроде записывают показания потенциометра (рН-метра). Находят по градуировочной прямой значение концентрации общих моноаминов, соответствующее значению потенциала.

Для контроля содержания аммония в крови (фоновое содержание NH ) проводят описанный опыт, только в состав реакцион-ной смеси вместо 0,5 г био-

и интенсивном перемешивании. Далее проводят все операции аналогично при меру 1 .

Находят по градуировочной прямой значение концентрации моноаминов 1 10 М, соответствующее значению потенциала. Имеющееся количество мо- ноамннов в разбавленной крови ничтожно и на результат не повлияет.

крови крысы в 0,15 М растворе КС1 55 (1:1), 1,5 мл К-фосфатного буфера рН 7,6, 0,32 мл 510 °М раствора серотонина, 0,24 мл 5-10 М раствора триамина, 0,24 мл 5-10 раствора бензиламина и 0,2 мл 5 10 М раствора

06

специфического катализатора с МАО- активностью прибавляют 0,5 мл 0,01 М К-фосфатного буфера рН 7,6. J Содерх ание аминов в крови рассчи- тывают как разность между общим ко- лич.еством аммиака и фоновым количеством аммиака.

Получают, что общее количество моноаминов в крови человека 0,36 мкг/мл

Пример2. О,5.г биоспецифического катализатора с МАО-актив- ностью помещают меж,цу мембранами ячейки 8 и промывают 0,01 М раствором боратного буфера (рН 7,6) и бидистиллированной водой. Ячейку 8 помещают в сосуд 1 для измерений элеястрода с газовым зазором, добавляют туда 1 мл крови крысы вО,15М

растворе КС1 (1:1), 1,7 мл К-фосфатного буфера рН 7,6, 0,32 мл5 10 М раствора серотонина, 0,24 мл 5-10 М раствора тирамина и 0,24 мл 5- 10 М раствора бензиламина. Таким образом, концентрации в реакционной смеси серотонина 4-10 М, триамина 3-10 М, бензиламина З Ю м. Общая концентра- ;дия моноаминов в реакционной смеси .Измерительный сосуд закрывают, помещают в термостат при 45°С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают 0 без СО2. Далее поток 0,2

перекрывают и герметически закрытьш сосуд 1 выдерживают 50 мин при 45.° С

I

и интенсивном перемешивании. Далее проводят все операции аналогично примеру 1 .

Находят по градуировочной прямой значение концентрации моноаминов 1 10 М, соответствующее значению потенциала. Имеющееся количество мо- ноамннов в разбавленной крови ничтожно и на результат не повлияет.

крови крысы в 0,15 М растворе КС1 (1:1), 1,5 мл К-фосфатного буфера рН 7,6, 0,32 мл 510 °М раствора серотонина, 0,24 мл 5-10 М раствора триамина, 0,24 мл 5-10 раствора бензиламина и 0,2 мл 5 10 М раствора

ацеклидина (концетрация ацеклидина в реакционной смеси 2,5-10 М) .

Измерительный сосуд закрывают, помещают в термостат при 45 С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают 0. без COj. Далее поток 0 перекрывают и герметически закрытый сосуд 1 выдераживают 50 мин при U5°C и интенсивном перемешивании. Далее

сивном перемешивании. Далее проводят все операции аналогично примеру 1.

По градуировочной прямой определяют концентрацию моноаминов 2,95 , что соответствует концетра- ции бензиламина в реакционной смеси.

В примере 3 получена общая концентрация тирамина и бензиламина 6,05-10 М, можно найти концентрацию

проводят все операции аналогично при- О тирамина: 6,05-10 -2, -3,1 меру 1.. .

Находят по градуировочной прямой П р и м е р 6. Определение ведут значение концентрации моноаминов аналогично примеру 5, но концентра- (6,05-10 м) . В примере 2 получена ция ацеклидина и 8--10 М сообщая концентрация моноаминов 1-10 М, 5 ответственно. Находят концентрацию

можно найти концентрацию серотонина 1 ,05 10 3,95 10 М (в анализе концетрация серотонина 4-10 М) . П р и м е р 4.. Определение ведут аналогично примеру 3, однако конечная концентрация ацеклидина 5-10 и 3,75 10 М. Находят концентрацию серотонина соответственно 4,7510 и 4,05-10 М.

Пример5. 0,5г биоспецифического катализатора с МАО актив- ностью помещают между мембранами ячейки 8 и промывают 0,01 М раствором боратного буфера (рН 7,6) и бидистиллироваиной водой. Ячейку 8 помещают в сосуд 1 для измерений с газовым зазором, добавляют туда 1 мл крови крысы в 0,15 М растворе КС1 (1:1), 0,9 мл К-фосфатного буфера рН 7,6, 0,32 мл раствора серотонина, 0,24 МП 5-1СГ М раствора TpHaivfflLHa, 0,24 мл 5-10 М раствора бензиламина и 0,8 мл 5-10 м раство- ра ацеклидина (концентрация ацеклидина в реакционной смеси 1-. 10 М). Измерительный сосуд закрывают, помещают в термостат при 45°С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускабензиламина 2,95- 2,80- Ю М.

Формула изобретения

20

1.Способ определения биогенных моноаминов путем их дезаминирования при помощи моноаминоксидазы с последующим потенциометрическим определением образовавшегося аммиака при

помощи рН-злектрода, отличающийся тем, что, с целью повышени чувствительности способа, в качестве моноаминоксидазы используют биоспецифический катализатор с моноамино30 ксидазной активностью, дезаминиро- вание проводят в течение не менее 50 мин, а определение аммиака ведут в присутствии насьш енного раствора хлористого калия при рН не менее 12.

2.Способ по п.1,отличающий с я тем, что, с целью селективного определения серотонина в смеси моноаминов, дезаминирование проводят в присутствии 2,510 - 510 М ацеклидина.

3.Способ ПОП.1, отличающийся тем, что, с целью селективного определения бензиламина в смеси моноаминов, дезаминирование

35

40

ют О JJ без

СО. Далее поток Оа перекры3.Способ ПОП.1, отличаю щийся тем, что, с целью селективного определения бензиламина в смеси моноаминов, дезаминирование

вают и герметически закрытый сосуд 1 45 проводят в присутствии 1-10 -8 10 вьщерживают 50 мин при 45°С и интен- метацина или ацеклидина.

сивном перемешивании. Далее проводят все операции аналогично примеру 1.

По градуировочной прямой определяют концентрацию моноаминов 2,95 , что соответствует концетра- ции бензиламина в реакционной смеси.

В примере 3 получена общая концентрация тирамина и бензиламина 6,05-10 М, можно найти концентрацию

П р и м е р 6. Определение ведут аналогично примеру 5, но концентра- ция ацеклидина и 8--10 М соответственно. Находят концентрацию

бензиламина 2,95- 2,80- Ю М.

Формула изобретения

0

1.Способ определения биогенных моноаминов путем их дезаминирования при помощи моноаминоксидазы с последующим потенциометрическим определением образовавшегося аммиака при

помощи рН-злектрода, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве моноаминоксидазы используют биоспецифический катализатор с моноамино30 ксидазной активностью, дезаминиро- вание проводят в течение не менее 50 мин, а определение аммиака ведут в присутствии насьш енного раствора хлористого калия при рН не менее 12.

2.Способ по п.1,отличающий с я тем, что, с целью селективного определения серотонина в смеси моноаминов, дезаминирование проводят в присутствии 2,510 - 510 М ацеклидина.

3.Способ ПОП.1, отличающийся тем, что, с целью селективного определения бензиламина в смеси моноаминов, дезаминирование

35

40

45 проводят в присутствии 1-10 -8 10 метацина или ацеклидина.

М

иг. 2

Редактор И.Николайчук

Составитель Н.Гуляева

Техред Л.Сердюкова Корректор С.Черни

Заказ 7259/42Тираж 776Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Произво чственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

Фиг. 3

Изобретение касается физико- химических методов анализа и может быть использовано в медицине и фармакологии. Цель изобретения --повышение чувствительности способа. Биоспецифический катализатор с моно- аминоксидазной активностью помещают на мембрану ячейки 8, которую размещают в сосуде 1 для измерений, до- . бавляют в сосуд боратный буфер и Тх х-J К) рБ tsD О О