Способ определения концентрации сульфидов в физических средах Советский патент 1993 года по МПК G01N33/18 

можным с применением биокатализатора с МАО активностью. Ингибирующее действие сульфидов на МАО оказалось сильнее, чем на другие ферменты, в том числе на перок- сидазу. Уже при концентрации HzS и сульфидов 1 -КГ5 М их ингибирующее действие вызывает заметное изменение ферментативной активности МАО. Применение фермента в иммобилизованной форме позволяет определить ферментативную активность препарата при повышенной температуре, обеспечивающей проявления наименьших изменений ферментативной активности.

Среда буфера с рН 7,0-9,0 оказалась- оптимальной для взаимодействия сульфидов с МАО. Данная область рН также обеспечивает смещение равновесия в процессе диссоциации Й25 в сторону образования ибна сульфида. Последний является ингиби- р.дрм фермента МАО. Степень ингибирова- нЙ1 МАО зависит от концентраций иона сульфида, следовательн.о, и от концентрации сероводорода. О степени инги- бирования МАО судят по изменению ферментативной активности в реакции окислительного дезаминироёания моноаминов, например шрамина, серЬтонйна.

Применение двух субстратов позволяет определить сульфиды при любой концентрации их в исследуемой среде. Это особенно важно для контроля высоких содержаний анализируемого вещества, например, в промышленных сточных водах, илах и т.д. МАО активность препарата можно измерять любым методом определения активности этого фермента (по Конвею, электродом с газовым зазором и др.).

Использование предложенного способа не требует предварительной обработки мутных или окрашенных сточных вод. Коллоидный состав анализируемой пробы не влияет на точность результата анализа. Отсутствие предварительной обработки анализируемой пробы исключает ошибку из-за возможного связывания присутствующего сульфида.

В случае измерения активности МАО с помощью электрода с газовым зазором ошибка составляет ± 1%, В предлагаемом способе объем анализа не влияет на точность результата. В случае высоких концентраций HaS анализируют меньший объем исследуемой пробы. Это особенно важно при анализе воздуха в зонах очистных сооружений, при метановом брожении активного ила и в биотазах при анаэробном сбраживании сельскохозяйственных отходов, где концентрация сероводорода может достигать 1.

Способ заключается в следующем. Определяется МАО активность иммобилизованного препарата по субстрату тирамину или серотонину. Ферментный

препарат инкубируется с пробой, содержащей N28 или растворенный сульфид при заданном рН 7,0-9,0 в буфере После инкубации определяется остаточная активность иммобилизованной МАО тем же способом определения активности. Находят соотношение ферментативных активностей Oo/Q и далее Ig вь/ft. По калибровочному графику соответствующего субстрата при данной температуре инкубации находят

концентрацию сульфида в анализируемой . пробе. .:.- . V . ; .-..- .. Л ри м е р 1. Определение исходной МАО активно стй.. .;/ :/:- - . ,.. : -- :.:V;-

0,4 г биокатализатора с МАО актйвио- стью согласно авт. свйд.№1146322 помещают в ячейку, которую на 10 мин помещают в 0,0f M фосфатный буфер с рН 7,0. Затем ячейку с ферментным препаратом переносят в тёрмбстатируемый сосуд электрода с газовым зазором. Туда же забивают реакционную смесь: 0,1 М фосфатного буфера 3 Мл (рН 7,0) и I мл субстрата - серотонина с концентрацией 4-10 М (концентрация в

пробе 1 М). В течение 10 мин через раствор пропускают кислород при постоянном перемешивании. Далее поток перекрывают и Терметически закрытый сосуд выдерживают 50 мин при 20°С с йнтенсивным перемешиванием. После инкубации ферментсодёржащую ячейку вынимают, в сосуд добавляют 1,4 г HCI, закрывают пробкой с рН стеклянным электродом, на поверхность которого помещена капля 0,2%-ного

раствора тритона Х-305 в. бидистиллиро- ванной воде, снова пропускают 02 без С02 и затем через капилляр вводят в реакционную смесь 0,2 мл 1 М NaOH () для полного освобождения аммиака. После установления постоянного потенциала (рН) на электроде ( 20 мин) записывают показания потенциометра (рН-метра).

Взаимодействие ферментного препарата с сульфидом и определение остаточной

ферментной активности.

, Ячейку с ферментным препаратом пере- носят из буферного раствора в анализируемый раствор следующего состава: 5 мл раствора NaaS с концентрацией 4,6-10 М

и 5 мл 0,01 М фосфатного буфера с рН 7,0. Инкубируют при перемешивании.

Затем ячейку с ферментом переносят в буфер для промывания и определяют остаточную МАО активность.

Для анализа используют тот же метод и те же условия, что для анализа исходной МАО активности.

Находят соотношение показаний потенциометра при анализе исходной и оста- точной активности, что является величиной во/ft, равной 1 33. Потом находят д во/ft, равный 0,12. По калибровочной кривой в координатах Ig во/ft -l(t) с использованием серотонина в качестве субстрата находят концентрацию сульфида (Г3 моль/л 1.0 мин, Разделением данной величины на 10 находят концентрацию сульфида в анализируемой пробе, т.е. 2, М.

Пример 2.

Определение исходной МАО активности аналогично примеру 1.

Взаимодействие ферментного препарата с сульфидом.

Ячейку с 0,4 г ферментного препарата переносят из буферного раствора с рН 8,0 в анализируемый раствор следующего состава: 5 мл раствора сул ьфида натрия с концентрацией 4, и 5 мл 0,01 М фосфатного буфера с рН 8,0 Инкубируют при переме- шИвании. . ....;/;. // /,////.

Определение остаточной МАО активности аналогично исходной МАО активности. Находят соотношение #о/$, равной 3,9, и далее Ig во/ft 0,59.

По калибровочной кривой с использованием серотонина в качестве субстрата находят концентрацию сульфида 2, М. // .Пример 3. ... / . ;;/

Определение исходной МАО активно- сти аналогично примеру 1.

Взаимодействие ферментного препарата с сульфидом.

Ячейку с 0,4 г ферментного препарата переносят из буферного раствора с рН 9,0 в анализируемый раствор следующего состава: 5 мл раствора NaaS с концентрацией 4, и 5 мл 0,01 М фосфатного буфера с рН 9,0. Инкубируют в пробе при перемешивании. Затем ячейку с ферментным препаратом переносят в буфер для промывания и определяют остаточную МАО активность аналогично определению исходной МАО активности. Находят соотношение во/ft, рав- ное 12,1, и далее Ig во/ft, равный 1,08.

По калибровочной кривой с использованием серотонина в качестве субстрата нахо

I - - г- хдят концентрацию сульфида 2,3-10 М.

П р и м е р 4.Определение исходной МАО активности аналогично примеру 1.

Ячейку с ферментсодержащим препаратом переносят из буферного раствора с рН 9,0 в анализируемый состав: 5 мл раствора Na2$ с концентрацией 4. М и 5 мл буфера с рН 9,0. Инкубируют с ферментным препаратом при перемешивании. Определяют остаточную МАО активность и находят соотношение во/ft, равное 11,8, и далее определяют д во/ft, равный 1,07. -.; i

По калибровочной кривой с использованием -тирамина в качестве субстрата находят концентрацию сульфида 2 -10 М.

П риме р 5.

Определение сульфидов в сточных во

дах. .: ; ....; / ;/ Определение исходной МАО активности аналогично примеру 1. ./

Анализируемый состав: 5 мл сточных вод, 5 мл буфера с рН 8,0. Инкубированйё с ферментным препаратом проводят при перемешивании в течение 60 мин при 20°С, Соотношение во/ft равно 1,1. Далее определяют Ig &/$, равный 0,04,

По калибровочной кривой с использованием тирамина определяют концентрацию сульфидов, равную М.

Ф ормула изоб рете н и я

Способ определения концентрации сульфидов в физических средах, предусматривающий отбор пробы среды, внесение ферментного препарата, растворённого в буфере в экспериментальную ячейку, добавление субстрата, выдерживание получен ной смеси, определение активности ферментного препарата, последующее внесение анализируемой пробы в реакционную смесь и повторное определение активности ферментного препарата, расчет соотношения полученных величин активностей ферментного препарата и определение концентрации сульфидов по калибровочному графику, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что, с целью повышения точности определения, в качестве ферментного препарата используют биокатализатор с моноаминооксидазной активностью, рН буферного раствора составляет от 7 до 9, а в качестве субстрата используют тирании или серотонин.

Изобретение относится к ферментному анализу и может применяться в химическом анализе, химико-технологическом анализе, для контроля загрязнения природных вод, почвы и атмосферы. Целью изобретения является повышение точности определения. В экспериментальную ячейку вносят биокатализатор с моноаминооксидаэной активностью, растворенный в буфере с рН 7-9, добавляют тирамин или серотонин, выдерживают полученную смесь, определяют активность фермента, вносят анализируемую пробу в смесь и повторно определяют активность фермента. После этого рассчитывают соотношение полученных величин активностей фермента и определяют концентрацию сульфидов в пробе по калибровочному графику. ел с Поставленная цель достигается тем, что в качестве ферментного препарата используют бмокатализатор с моноаминоксидаз- ной активностью, рН буферного раствора составляет от 7 до 9, а в качестве субстрата используют тирамин или серотоник. Повышение точности определения предложенным способом оказалось воз00 I о ел