Способ получения ферментсодержащих пленок для определения моноаминов Советский патент 1990 года по МПК C12N11/10 C12N9/06 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению ферментсодержащих препаратов для химического, клинического и токсикологического анализа.

Целью изобретения является улучшение качества ферментсодержащих пленок за счет повышения избирательное- ти анализа моноаминов и увеличения срока годности пленок.

Способ заключается во введении препарата моноаминоксидазы в буфер-,, ный раствор желатина, нанесении полу ченного раствора на подложку, высушивание раствора на воздухе для получения пленки и ее обработки глутаро- вым альдегидом с последующей инкубацией пленки в течение 40-50 мин в растворе ингибитора-профлавина в концентрации ... 8 10 4М или 1 ...1,5 .

При обработке профлавином в концентрации 5 О..,8 1 0 М ингиби- руется активность моноаминоксидазы В, катализирующую деэаминирование бен- зиламина Такая пленка пригодна для избирательного определения тирамина . й серотонина. При концентрации проф- лавина 1 -10 3. „. 1 ,5 -1 ингибирует- ся моноаминоксидаза, дезаминирующая тирамин. Полученный препарат пригоден для определения серотонина.Совместное или раздельное использование ферментсодержащих пленок позволяет

ел

&

00

олее избирательно определять моно- Змины в биологических жидкостях. Срок одности пленок возрастает в 3 раза

Пример 1. О,5 г желатина помещают в стаканчик с 10 мл дистилли рованной воды для набухания. Затем туда же добавляют 10 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,4,, и нагревают При перемешивании до полного растворения желатина. Далее раствор охлаждают до +25 С и вносят в него 2 г го- огената митохондрий печени свиньи или 0,01 г лиофилизировэнной моно- аминоксидазы в 1 мл 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,4, перемешивают. Смесь порциями по 5 мл выливают на ровную поверхность полиэтиленовой пластинки и высушивают в потоке воздуха в течение 1,5 ч. Сухую пленку желатина с включенной в ней моноаминоксидазой обрабатывают 10 мл 4%-ного раствора глутарового альдегида (ГА) в течение 3-5 мин. После этого избыток раствора ГА сливают, а пленку многократно промывают водой и 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,4 и снова высушивают в потоке воздуха в течение 1 ч (образец 1). Далее одну сухую пленку обрабатывают 10 мл 7,610 моль/л раствором профлавина в течение 45 мин. После обработки профлавином пленку высушивают в потоке воздуха при + 15°С (образец 2).

Третью пленку, высушенную после обработки глутаровым альдегидом, обрабатывают 10 мл 1,3 10 3моль/л раствором профлавина в течение 45 мин. После обработки профлавином пленку высушивают в потоке воздуха при 15 С (образец 3).

Ферментсодержащие пленки хранят в холодильнике при 4-10°С.

Результаты опытов приведены в лице„ Все пленки получают- аналогично ,примеру 1 за исключением концентрации ингибитора и продолжительности обработки, которые указаны в таблице

Проверка полученных ферментсодер- жащих пленок проведена согласно приведенной методике.

Определение моноаминов в биологической жидкости

Ферментсодержащий препарат - пленку с МАО активностью (образец 1} помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют туда же 3,5 мл 0,15 моль/л раствора КС1 или NaCl и 0,5 мл исследуемой

5

О

5

0

5

0

35

40

45

50

55

крови человека .Измерительный сосуд закрывают, помещают в термостат при 35 С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают Ог без С0,. Далее поток 0 перекрывают и герметически закрытый сосуд выдерживают„30 мин при 35 С с интенсивным перемешиванием. После инкубации ферментсодержащую пленку вынимают, в сосуд добавляют 1,4 г КС1, охлаждают сосуд до 25°С, закрывают пробкой с рН стеклянным электродом, на поверхность которого помещена капля 0,2%-ного раствора тритона Х-305 (ПАВ) в бидистиллиро- ванной воде, снова пропускают 0 без COi и затем через капилляр вводят в реакционную смесь 0,2 мл 1 моль/л NaOH (рН раствора 12) для полного освобождения NH}. После установления постоянного потенциала (рН)(20 мин) на электроде записывают показания потенциометра (рН-метра). Находят по градуировочной прямой значение концентрации общих моноаминов (MAJ, соответствующее значению потенциала.

Для контроля содержания аммония в крови (фоновое содержание NH3) проводят описанный опыт только в реакционной смеси, вместо ферментсо- держащей пленки с МАО активностью помещают контрольную желатиновую пленку без фермента.

Общее содержание моноаминов в крови рассчитывают как разность между общим количеством аммиака минус фоновое количество аммиака. Оно составляет 0,33 мкг/мл крови

Содержание тирамина и серотонина в модельной смеси.

Ферментсодержащий препарат - плен- ку с МАО активностью, обработанную профлавином с концентрацией 6 xl О 4 моль/л (образец 2) помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют 0, 32 мл 5-10 моль/л раствора серотонина, 0,24 мл 5 НО моль/л раствора тирамина и 0,24 мл 5-10 ьмоль/л раствора бензил- амина с, Туда же добавляют 3,2 мл К- фосфатного буЛера, рН 7,6. Таким образом, концентрация в реакционной смеси: серотонина 4-10 моль/л, тирамина - 3 1 О 7моль/л, бенчннамина - 3 10 моль/л.

Общая концентрация мэноамичов в реакционной смеси 1-10 мопь/л.

Измерительный сосуд закрывают, помещают в термостат при -;гэгС, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают Ог без COji. Далее поток О г перекрывают и герметически закрытый сосуд выдерживают 50 мин при 45°С и интенсивном перемешивании. Далее проводят все операции аналогично примеру 1 .

Находят по градуировочной прямой значение концентрации суммы серотони- на и тирамина, т.е„ 7 Ч О 7моль/л, соответствующее значению потенциала

Определение серотонина в модельной смеси

Ферментсодержащий-препарат - пленку с МАО активностью, обработанную фосфатным буферным раствором профла- вина с концентрацией ингибитора ,3х х10 моль/л в течение 45 мин (образец 8), помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют туда 0,32 мл 5 10 моль/л раствора серотонина, 0,24 мл моль/л раствора тирамина и 0,24 мл 5 1 0 моль/л раствора бензиламина„ Туда же добавляют 3,2 мл К-фосфатного буфера, рН 7,6. Концентрация в реакционной среде, моль/л: серотонин 4 -1 0 7;тирамин 3-1 бен- зиламин 3 -1 0 ,

Общая концентрация моноаминов в реакционной смеси 1 -10 моль/л.

Измерительный сосуд закрывают, помещают в термостат при 45 С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают О 1 без СО г.

Затем поток 0-2 перекрывают и герметически закрытый сосуд выдерживают 50 мин при 45°С и интенсивном перемешивании. Далее проводят аналогично примеру 1,

Находят по градуировочной прямой значение концентрации серотонина 3 1 О 1 моль/л, соответствующее значению потенциала

П р и м е р 2. Определение суммарного количества тирамина и серотонина

0,5 г желатина помещают в стакан- чике с 10 мл дистиллированной воды для набухания. Затем туда же добавляют 10 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,4, и нагревают при перемешивании до полного растворения желатина. Далее раствор охлаждают до +25°С и вносят в него 2 г гомогената митохондрий печени свиньи в 1 мл 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,4, перемешивают. Смесь выливают на ровную по-

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

верхность и высушивают в потоке воздуха в течение 1,5 ч. Сухую пленку желатина с включенной в ней МАО обрабатывают 10 мл 4%-ного раствора глу-. 1тарового альдегида в течение 5 мин. После этого избыток раствора альдегида сливают, а пленку многократно промывают водой и 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,4, и снова высушивают в потоке воздуха в течение I ч.

Сухую желатиновую пленку с МАО активностью обрабатывают 10 мл раствора профлавина с концентрацией 5-10 4моль/л в течение 40 мин. После обработки избыток раствора сливают, пленку промывают фосфатным буфером и высушивают в потоке воздуха

Пленка пригодна для определения суммарного количества тирамина и серотонина в биологических жидкостях.

Пленку помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, , добавляют 3,5 мл 0,15 моль/л раствора КС1 и 0,5 мл исследуемой крови человека.

Измерительный сосуд закрывают, помещают в термостат при 40°С, включают магнитную мешалку и 10 мин пропускают 0 без СОт.. Далее поток перекрывают и герметически закрытый сосуд выдерживают 50 мин при 40 °С с интенсивным перемешиванием. После инкубации ферментсодержащую пленку вынимают, в сосуд добавляют 1,4 г КС 1, охлаждают сосуд до 25°С, закрывают пробкой с рН стеклянным электродом, на поверхность которого помещена капля 0,2%-ного раствора тритона Х-305 в бидистиллированной воде, снова пропускают О-z. без СО а и затем через капилляр вводят в реакционную смесь 0,2 мл 1 моль/л NaOH (рН 12), для полного освобождения аммиака. После установления постоянного потенциала (рН) на электроде записывают показания рН-метра.

По градуировочной прямой находят значение суммарной концентрации тирамина и серотонина 0,26 мкг/мл крови, соответствующее значению потенциала.

П р и м е р 3. Определение содержания тирамина и серотонина в крови ведут аналогично примеру 2, однако применяют Ферментсодержащий препарат-желатиновую пленку с МАО активностью обработанную профлавином с концентрацией 840 моль/л в течение 50 мин.

71564187

По градуировочной прямой находят

суммарную концентрацию тирамина и сератонина 0,27 мкг/мл крови.

ПримерАо Получают желатиновую пленку с МАО активностью согласно примеру 2. -Сухую пленку обрабатывают 10 мл фосфатного буферного раствора профлавина с концентрацией 4 10 моль/л в течение 35 мин.

После обработки высушенную пленку проверяют для определения тирамин и серотонина в крови.

Инкубирование и определение аналогично примеру 2. Объем исследуемой крови также 0,5 мл. По градуировочной прямой находят значение концентрации лмоноаминов 0,30 мкг/мл, соответствующее значению потенциала. В данном случае результат завышен из-за недостаточного ингибирования активных центров МАО, ответственных за дезаминирование бензиламина и, следовательно, определяется еще и т часть бензиламина.

Пример 5. В сосуд для измерений электрода с газовым зазором помещают ферментсодержащий препарат - желатиновую пленку с МАО активностью, обработанную профлавином с концентрацией 9,5 -10 4моль/л„ Добавляют 3,5 мл 0,15 моль/л раствора KCl и 0,5 исследуемой крови. Инкубирование и оп- ределение аналогично примеру 2.

По градуировочной прямой находят значение суммарной концентрации моноаминов 0,24 мкг/мл. В данном случае результат занижен, поскольку завышенная концентрация ингибитора час- тично ингибировала уже активные центры МАО, ответственные за дезами- нирбвание тирамина и, следовательно, определяется все количество серото- нина и только часть тиракина. Препарат не пригоден для суммарного определения тирамина и серотонина.

П р и м е р 6. Ферментсодержащий препарат - желатиновую пленку с МАО активностью, обработанную профлавином с концентрацией 1,3 -10 эмоль/л в течение 40 мин, помещают в сосуд для измерений электрода с газовым , зазором, добавляют 3,5 мл 0,15 мл/л раствора КС1 и 0,5 мл исследуемой крови человека.

Далее проводят все операции аналгично примеру 2.

8

5

0

5

5

0

о

5

0

5

Находят по градуировочной прямой значение концентрации серотонина 0,15 мкг/мл.

Пример. Определение ведут аналогично примеру 2 с использованием желатиновой пленки, обработанной профлавином с концентрацией 1,5 Ч моль/л.

Находят концентрацию серотонина О,15 мкг/мл.

П р и м е р 8. Определение ведут аналогично примеру 2 с использованием желатиновой пленки, обработанной - профлавином с концентрацией 1,4 х моль/л в течение 50 мин.

Найденная концентрация серотонина 1,15 мкг/мл,

П р и м е р 9. Ферментсодержащий препарат - пленку с МАО активностью, обработанную профлавином с концентрацией 9,0.10 моль/л в течение 60 мин, помещают в сосуд. Добавляют 3,5 мл 0,15 моль/л раствора КС1 и 0,5 мл исследуемой крови. Далее инкубирование и определение аналогично примеру 2.

По градуировочной кривой находят значение концентрации моноамина 0,17 мкг/мл. В данном случае результат концентрации серотонина завышен, поскольку концентрация ингибитора профлавина была недостаточной для полного ингибирования активных центров МАО, дезаминирующих тирамин, и, следовательно, вместе с серотони- ном определяется еще часть тиранина. Пример 10. Ферментсодержащий препарат - пленку с МАО активностью , обработанную профлавином с концентрацией 1,6 моль/л в течение 45 мин, помещают в сосуд. Добавляют 3,5 мл 0,15 моль/л раствора КС1 и 0,5 исследуемой крови. Далее инкубирование и определение аналогично примеру 2.

По градуировочной кривой находят значение концентрации моноамина 0,15 мкг/мл. Так же как в примерах j- 8 определяется все количество серотонина. Следовательно, оптимальным препаратом для определения серотонина является пленка, обработанная препаратом профлавином с концентрацией 1 1,5 моль/л. Применение препарата, обработанного увеличенным количеством ингибитора, не требуется и является нецелесообразным.

Желатиновые пленки, обработанные профлавином, пригодны для многократного использования, поскольку проф- лавин является необратимым ингибитором МАО и в условиях использования пленок профлавин не вымывается в течение всего срока пригодности, который лимитируется механической сохранностью пленки. Срок годности пленки 4 мес (при проведении 5 определений ежедневно), В сухом виде при 4-10 С- ферментативная активность пленки сохраняется в течение 9 мес.

Таким образом, предложенный способ позволяет получить ферментсодер- жащие пленки, пригодные для определения моноаминов, с улучшенными характеристиками, а именно с увеличенными избирательностью и сроками годности. В 3 раза увеличивается срок годности и возникает возможность совместного и раздельного определения моноаминов в биологических жидкостях без введения в систему для определения

5

0

5

дополнительных количес - ч -ц ион f cj,or моноаминоксидаз. Препарат обеспечивает предел обнаружения моноаминов до 10 s M.

Формула изобретения

Способ получения ферментсодержа- щнх пленок для определения моноаминов, включающий введение препарата моноаминоксидаэы в буферный раствор желатина, нанесение полученного раствора на подложку, высушивание раствора на воздухе для получения пленки и последующую обработку поверхности пленки глутаровым альдегидом, отличающийся тем, что, с целью улучшения качества ферментсо- держащих пленок за счет повышения избирательности анализа моноаминов и увеличение срока годности пленок, полученную пленку обрабатывают в течение 40-50 мин раствором ингибитора- профлавина в концентрации 5-1СГ4... 8 -Ю-4 М или 1 -1СГ3 ...1,5НО-3 М.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению ферментсодержащих препаратов для химического, клинического и токсикологического анализа. Цель изобретения - улучшение качества ферментсодержащих пленок за счет повышения избирательности анализа моноаминов и увеличение срока годности пленок. Способ заключается в получении желатиновых пленок, содержащих моноаминоксидазу и обработанных глутаровым альдегидом, и инкубации полученных пленок в течение 40-50 мин раствором ингибитора-профлавина в концентрации 5^.10^-4-8^.10^-3-1,5^.10^-3 М. Пленки могут быть использованы для совместного и раздельного определения разных моноаминов в биологических жидкостях. У пленок в 3 раза увеличивается срок годности, предел обнаружения моноаминов 10^-9 М. 1 табл.

Без обработки профлавином

3-Ю 7 4-Ю-1 З КГ7 1 10-

6-10-4

45

j Ю-1 3. 1 10

8 10-1

50

J Ю-7 4-Ю 7 3 1010-10-4

40 35

3 Ю-7 4 Ю-7 3 -IO З Ю 7 4 Ю-7 З Ю

6

9-10-+

60

3-.1Q-7 4-Ю 7 з 1 -ю-

7 1 10-

ilO

-

7 1 10

-

(Суммарное количество тиракчна, серотонина и бензил- амина

7,00 10 7 Суммарное количество тирамина и серотонина

7

10i -ю-

6,95 10

-7

6,97-10

1 -ю-

Суммарное количество тирамина и серотонина 1

8,5 -10 7 Суммарное количество тирамина и серотонина, члсть бенэиламина

5,8-1 О 7 Общее количество серо тонина и

11

1564187

1 -К) 3

40

34 4-i,-T

12

.Продолжение таблицы ,

1 -10

-t

часть тирами на 3,98-10 7 Только се