Способ определения адреналина в биологическом материале Советский патент 1990 года по МПК G01N33/74 

Изобретение относится к области физико-химических методов анализа, в частности к потенциометрическому определению микроколичеств адреналина в биологическом материале, и может быть использовано в фармакологии .

Цель изобретения - ускорение способа при одновременном повышении ее точности.

Способ осуществляется следующим образом,

В электродный сосуд помещают борат- ный буфер рН 7,6. Затем туда же добавляют ферментный препарат с моноамино- ксидазной (МАО) активностью и раствор адреналина. Пропускают над реакционной смесью кислород, затем плотно закрывают сосуд и инкубируют смесь при 37°С. Вынимают иммобилизованный

препарат из реакционной среды, добавляют хлорид калия до насыщения, закрывают сосуд пробкой с вмонтированным в нее рН-электродом с каплей тритона Х-305. Снова пропускают над реакционной смесью кислород, а затем через капилляр вводят раствор гидрокси- да натрия до рН 12 и выше для полного выделения метиламинт. После установления постоянного потенциала регистрируют показания рН-метра и по граду- ировочной прямой определяют концентрацию адреналина. Чувствительность способа составляет 5 .

В основе предлагаемого способа лежит реакция дезаминирования адреналина под воздействием биоспеиифичес- кого катализатора с моноамгшоксидазСЛ

0

№

00 СП

00

ной активностью (МАО), полученного из митохондрий:

о2:

НО-О-СН-СНгШСН3+НгО

ОН

но- О-сн-сно+ш2сн31-Ж202 10 он

Образующийся при дезаминировании метиламин в присутствии насыщенного раствора хлорида калия можно вытеснить из реакционной среды и, таким образом, определить его количество потенциометрически. Градуировочная прямая в координатах Е (потенциал) - отрицательный логарифм концентрации адреналина, полученная при полном дезаминировании адреналина показывает, что область линейной электродной функции достигает 5 1 моль/л,

Пример 1„ Анализ содержания адреналина в экстракте сердца морско свинки.

Способ реализуют в устройстве для определения моноаминов. В электродный сосуд помещают 1 мл 0,1 М борат- ного буфера рН 7,6, 2 мл экстракта и 1 мл дистиллированной воды. Затем добавляют 0,06 г ферментного препарата с МАО активностью и пропускают над реакционной смесью кислород в течение 5-10 мин. Плотно закрывают сосуд и инкубируют смесь при 37 С в течение 60 мин. Далее вынимают фер

ментный препарат из реакционной сре

ды, добавляют туда 1,2 г хлорида калия, закрывают сосуд пробкой с вмонтированным в нее рН-электродом с каплей Тритона Х-305. Снова пропускают над реакционной смесью кислород в тече- ние 5-10 мин, а затем через капилляр вводят раствор гидроокиси натрия 5 М до рН 12 для полного выделения метиламина о После установления постоянного потенциала (30 мин) регистрируют показания рН-метра и по градуиро вочной прямой определяют концентрацию адреналина,.равную 5 -10 моль/л.

П р и м е р 2 , Анализ содержания адреналина в моче кошки.

Предварительно выделяют из пробы мочи катехоламины (КА) путем адсорбции на окиси алюминия в щелочной среде. Адсорбированные норадреналин и

5

0

0

5

0

0

5

дофамин легко окисляются кислородом, особенно в присутствии тяжелых металлов, что позволяет отдельно определить адреналин, так как адреналин окисляется только при рН 3. Приготовленный таким образом элемент используют для определения адреналина. В электродный сосуд помещают 1 мл бо- ратного буфера рН 7,6 и 1 мл элюента, добавляют 2 мл дистиллированной воды. Затем туда же добавляют 0,06 г ферментного препарата с МАО активностью. Далее проводят операции аналогично примеру 1. По градуировочной прямой определяют концентрацию адреналина, равную 5 М.

ПримерЗ. В электродный сосуд помещают 2 мл 0,1 М боратного буфера с рН 7,6, добавляют 1,8 мл дистиллированной воды. Затем туда же добавляют 0,06 г биокатализатора с МАО активностью и 0,2 мл раствора адреналина 0,1% (т.е. 2, моль/л). Далее проводят инкубацию аналогично как в примере 1. После инкубации добавляют 1,2 г хлорида калия, пропускают кислород, а затем вводят раствор гидроокиси натрия до установления рН 12,0. Через 30 мин после полного выделения метиламина и установления постоянного потенциала регистрируют показания рН-метра и по градуировочной прямой определяют концентрацию адреналина, равную 2, моль/л.

П р и м е р 4. В электродный сосуд помещают 2 мл 0,1 М боратного буфера рН 7,6, добавляют 1,8 мл дистиллированной воды, 0,06 г биокатализатора с МАО активностью и 0,2 мл раствора адреналина 0,1% (из ампулы). Далее проводят анализ аналогично примеру 1,. за исключением установления рН среды при выделении метиламина, равным 12,5.

По градуировочной прямой определяют концентрацию адреналина, равную 2,52-10 моль/л. Таким образом, рН среды 12,5 обеспечивает полное выделение образовавшегося метиламина.

Предлагаемый способ обладает следующими преимуществами по сравнению с известным:

продолжительность определения адреналина составляет 2-2,5 ч, в известном 5-6 ч;

высокая точность определения - ошибка метода составляет 1,5%, по известному способу.

5 . 15628586

Формула изо бретения точности, к анализируемой пробе добавляют хлористый калий до насыщения,

Способ определения адреналина в инкубируют в присутствии биокатализа- биологическом материале, включающий тора с моноаминоксидаэной активностью обработку исследуемой пробы с последу- при рН, большем или равном 12, до ющим определением продукта превраще- полного дезаминирования адреналина, ния адреналина и расчетом его калиб- а в качестве продукта превращения ровочной кривой, отличающий- адреналина определяют метиламин, со- с я тем, что, с целью ускорения спо- JQ держание которого регистрируют потен- соба при одновременном повышении циометрически.

Изобретение относится к физико-химическим методам анализа и может быть использовано в фармакологии. Цель - ускорение способа при одновременном повышении ее точности. В электродный сосуд помещают боратный буфер PH 7, 6, ферментный препарат с моноаминооксидазой и раствор адреналина, добавляют хлористый калий, инкубируют в присутствии биокатализатора с моноаминооксидазной активностью при PH, большем или равном 12, до полного дезаминирования адреналина. Потенциометрически определяют метиламин - продукт превращения адреналина. Продолжительность способа сокращается в 2 - 3 раза, а ошибка метода уменьшается на 8,5%.