Способ количественного определения биогенных моноаминов Советский патент 1989 года по МПК C12Q1/26 G01N33/48 C12N11/02 

Изобретение относится к физико- химическим методам анализа, в частности к потенциометрическому определению микроколичества моноаминов в биологических средах, и может быть использовано для клинического и токсикологического анализа в медицине и фармакологии.

Цель изобретения - расширение функциональньк возможностей способа, упрощение и удешевление.

.Определение общего количества биогенных моноаминов осуществляют при помощи ферментсодержащего препарата в виде желатиновой пленки с моноами- нооксидазной (МАО) активностью, причем суммарное количество тирамина и

серотонина определяют при помощи ферментсодержащего препарата, обработанного профлавином с концентрацией (5-8)-10 моль/л, а количество серото- кина при помощи ферментсодержащего препс рата, обработанного профлавином с концентрацией (1-1,5)1 О моль/л.

Изобретение обеспечивает расширение функциональных возможностей способа за счет BOSMOS IOCI) определения тирамина.и серотонина как в сумме, так и избирательно.

Способ осуществляют следующим образом.

Ферментсодержащий препарат - желатиновую пленку с МАО активностью - помещают в сосуд ддт и:змерения элексл

00

со

СП

трода с газовым зазором, добавляют исследуемый раствор. В закрытом сосуде в термостате при перемешивании проводят инкубацию. После инкубации ферментсодержащую пленку вынимают, добавляют КС1, охлаждают, закрьшают пробкой с рН-электродом, вводят раствор NaOH (рН 12) для освобождения аммиака. После установления постоянного потенциометра находят по градуи ровочной прямой значение концентраци моноаминов, соответствующее значению потенциала.

Для определения общего количества моноаминов используют ;1ерментсо- держащий препарат с МАО а тивностью без обработки ингибитором.

Дпя определения суммы тирамина и серотонина используют феоментсодер- жащий препарат с I-IAO активностью, обработанный профлавином с концентрацией (5-8)- 10 моль/л.

Для определения количества серотонина исподьзуют ферментсодержащий препарат с МАО активностью, обработанный профлавином с концентрацией (1-1 ,5) -I О моль/л.

Пример 1. Ферментсодержащий препарат для определения моноаминов в биологических жидкостях получают следующим образом. 0,01 г МАО (моно- аминооксидазы)или 2 г гомогената митохондрий печени с МАО активностью растворяют в 0,05-0,07 М фосфатном буфере с рН 7,3-7,5 и смешивают с 2-7%-ным раствором желатина. Получен ную смесь вьшивают на нерастворик у1о подложку и высушивают в потоке воэ- духа. Поверхность полученной пленки обрабатывают 2-8%-ным раствором глу тарового альдегида (ГА) в течение 3-5 мин. Избыток ГА сливают и промывают водой и фосфатным буферным раствором с РН 7,3-7,5. Далее желатиновую пленку, содержащую МАО, обрабатывают фосфатным буферным раствором профлавина с концентрацией ингибитора (5-8) Ю моль/л или (1 Г,5) О моль/л в течение мин. noTorf избыток раствора сливают, промывают пленку фосфатным буфером и высушивают в потоке воздуха при комнатной температуре. Пленки, полученные из 0,5 г желатина, обрабатывают 30 МП раствора профлавина.

Активность моноаминооксидазы, включенной в желатиновые пленки, по разным субстратам:

0

5

0

5

0

5

0

0

5

по тирамину - не менее А,55 10 мкмоль/мг белка;

по серотонину - не менее 3,7 40 мкмоль/мг белка;

по бензиламину - не менее 3,1 «К) мкмоль/мг белка шш 1600Е/Г препарата (условные спектрофотомет- рические единицы),

За условную единицу активности МАО принимают такое количество фермента, которое обуславливает увеличение оптической плотности при 250 нм в 10-ь5иллиметровой кювете при 25(; на 0,001 ед. за 1 мин.

За единицу активности МАО принято такое количество фермента., которое за 1 мин ферментативно ргющепля- ет 1 мкмоль субстрата.

Желатиновые пленки, обработанные профлавином, пригодны для многократного использования, поскольку проф- лавин является необратимым ингибитором МАО и в условиях использоваршя пленок не вымывается в течение всего срока пригодности, который лимитируется механической сохранностью пленки. Срок годности пленки Н мес (при проведении пяти опредиленш е/;седневно). В сузсом виде при 4- ферментативная активность кленки сохраняется в течс-ине 9 мес

Определение общего клличества моноаминов .

И р и м е р 2. Ферментсодержащий ирепарат - желатиновую пленку с МАО активностью размером 1x1 см - помецз- :ог в сосуд для Измерений электрода с газовым зазором, добавляют к5 мл 0,15 моль/л раствора КС1 и 0,3 глп исследуемой крови человека. Измерительный сосуд закрьшают, помещают к термостат при , включают маг-- нитнут-э мешалку и IО мин пропускают

0,; без СО-2. Далее поток перекрьшают JH гермети 1ески закрытый сосуд выдерживают 50 мин при с интенсивным перемешиванием. После инкубации фер- ментсодержащую пленку вынимают, в сосуд добавляют 1,4 г КС1, охлаждают

осуд до , закрывают пробкой со стеклянным рН электродом, на поверхность которого помещена капля 0,2%- ного раствора тритона X-305 в бидис- тиллированной воде, снова пропускают 0, без СО, а затем через капилляр вводят а реакционную смесь 0,2 м-п

1моль/л NaOH (рН 12) для полного освобождения аммиака. После установления постоянного потенциала (рн) ( мин) на электроде записывают показания потенциометра (рН-метра).

По градуировочной прямой находят значение концентрации общих моноаминов, соответствующее значению потенциала.

Для контроля содержания аммония в крови проводят аналогичный холостой опыт с желатиновой пленкой без фермента.

Общее содержание моноаминов рассчитывают как разницу между общим количеством аммиака и фоновым количеством аммиака в холостой пробе.

Общее количество моноаминов в крови 0,36 мкг/мл крови. Во всех опытах использована кровь одного донора.

П р и м е р 3. Ферментсодержа- щий препарат - желатиновую пленку с МАО активностью размером 1x1 см, использованную в примере 2, - прополаскивают водой и помещают в сосуд для измерения электрода с газовым зазором,добавляют 0,24 мл 5-1 О моль/л раствора бензиламина, 0,24 мл 5-10 моль/л раствора тирамина, 0,32 мл 510 моль/л серотонина и 0,2 мл 5-10 моль/л фенилэтиламина. Туда же добавляют 3 мл К-т юсфатного буфера рН 7,6. Общий объем реакционой смеси 4,0 мл. Концентрация в реакционной смеси, моль/л: бензил- амин 3-10 ; тирамин 3 10 ; серото- НИН 4 10 ; фенилэтиламина 2,5МО . Общая концентрация моноаминов в реакционной смеси 12,5 МО моль/л.

Проведение инкубации и определение аналогично примеру 2,

По градуировочной прямой находят общее количество моноаминов (12,6« 10 моль/л).

Определение суммарного количества тирамина и серотонина.

П р и м е р 4. Ферментсодержащий препарат - желатиновую пленку с МАО активностью, обработанную профяави- иом с концентрацией 5-10 моль/л, - помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют 3,5 МП Q,15 моль/л раствора КС1 и 0,5 мл исследуемой крови чеговека.

Далее проводят все операции аналогично примеру 2.

Находят по градуировочной прямой значение суммарной концентрации тирамина и сепотонина (0,2 мкг/мл крови), соответствующее значению потенциала.

Пример5. Определение ведут аналогично примеру 4, однако применяют Ферментсодержащий препарат - желатиновую пленкх с МАО активностью, обработанную профлавином с концент0 рацией 8-10 моль/л.

Находят суммарную концентрацию тирамина и серотонина (0,27 мкг/мп). П р и м е р 6. Определение ведут аналогично примеру 4, однако приме5 няют желатиновую пленку с МАО активностью, обработанную профлавином с концентрацией 6,5-10 моль/л.

Суммарная концентрация тирамина и серотонина 0,27 мкг/мл.

Пример7.В сосуд для измерений электрода с газовым зазсфом помещают ферментсодержаний препарат - желатиновую пленку с МАО активностью, обработанную ингибитором профлавином с концентрацией 4 ,0-10 моль/л. Добавляют 3,5 мл 0,15 мл/л раствора КС1 и 0,5 МП исследуемой крови человека. Далее проводят инкубирование и определение аналогично примеру 2.

0 По градуировочной прямой находят значение концентрации моноаминов (0,30 мкг/мп), соответствующее значению потенциала. В данном случае результат завьщ1ен из-за недостаточно5 го ингибирования активных центров

МАО, ответственных за дезаминирование бензиламина и, следовательно, определяется еще и часть бензиламина.

0 Пример8.В сосуд для измерений электрода с газовым зазором помещают Ферментсодержащий препарат желатиновую пленку с МАО активностью, обработанную ингибитором профлавином

5 с концентрацией 9,51) моль/л. Добавляют 3,5 МП 0,15 моль/л раствора КС1 и 0,5 мл исследуемой крови человека. Далее проводят инкубирование и определение аналогично примеру 2.

0 По градуировочной прямой находят значение суммарной концентрации моноаминов (0,24 мкг/мл). В данном случае результат занижен, поскольку завьшенн ая концентрация ингибитора

5 частично ингибировала уже активные центры МАО, ответственные за дезами- нирование тирамина и, следовательно, определяется все количество серотонина и только часть тирамина.

71

П р и м е р 9. Ферментсодержащий препарат - пленку с МАО активностью, обработанную профлавином с концентрацией 6 1 О моль/л,- помещают в сосуд для измерений электрода с газовым зазором, добавляют 0,32 ил 5 ЧСГ моль/л раствора серотонина, 0,24 мл 5-10 моль/л раствора тирами на и 0,24 мл 5 10 моль/л раствора бензиламина. Туда же добавляют 3,2мл К-фосфатного, буфера, рН 7,6. Общая концентрация моноаминов в реакционной смеси 1 -10 моль/л (с(:ротонина 4 -10 моль/л, тирамина 3-10 моль/л, бензиламина 3 Ч О моль/л).

Определение аналогично примеру 2. По градуировочной прямой находят значение концентрации cyt-iMbi тирамина и серотонина (7-10 моль/л), соответствующее значению потенциала. Определение серотонина. П р и м е р 10. Ферментсодержащий препарат - желатиновую пленку с МАО активностью, обработанную профлавином с концентрацией 1,3-1 моль/л,- помещают в сосуд для измерения электрода с газовым зазором, добавляют 3,5 мл 0,15 моль/л раствора КС1 и 0,5 мл исследуемой крови человека. Далее проводят все операции аналогично примеру 2. Находят по градуировочной прямой значение концентрации серотонина (0,15 мкг/мп).

Пример 11. Определение ведут аналогично примеру 10 с использованием желатиновой пленки, обработанной профлавином с концентрацией 1,5 , МО- моль/л.Находят концентрацию серотонина (0,15 мкг/ип).

П р и м е р f 2. Определение ведут аналогично примеру 10 с использованием жепатиновой пленки, обработанной профлавином с концентрацией 1,4-1 О -моль/л. Найденная концентрация серотонина 0,15, мкг/мп.

Пример 13. Ферментсодержащий препарат - пленка с МАО активностью, обработанная профлавином с концентрацией 9,0-1 О моль/л. Добавляют 3,5 мл 0,15 моль/л раствора КС1 и 0,5 мп исследуемой крови. Далее осуществляют инкубирование и определение аналогично примеру 2.

По градуировочной кривой находят значение концентрации моноамина (0,17 мкг/мп). В данном случае результат концентрации серотонина завьппен, поскольку концентра1Ц1я

5

0

83758

ингибитора профлавина недостаточна для полного ингибирования активных центров МАО, дезаминируюишх тирамин, и, следовательно, вместе с серотони- ном определяется еще и часть тирамина.

Пример 14. Ферментсодержащий препарат - пленка с МАО активностью, обработанная профлавином с концентрацией 1,610 моль/л. Добавляют 3,5 мл 0,15 моль/л раствора КС1 и 0,5 мл исследуемой крови. Далее осуществляют инкубирование и определение аналогично примеру 2.

По градуировочной кривой находят значение концентрации моноамина (0,15 мкг/мл). Аналогично примерам 10-12 определяют все количества серотонина. Следовательно,оптимальным препаратом для определения серотонина является пленка, обработанная профлавином с концентрацией (1- 1,5)-10 моль/л. Применение препара- 5 та, обработанного увеличенным количеством ингибитора, не требуется и является нецелесообразным.

Пример 15. Ферментсодержащий препарат - пленку с МА.О активностью, д обработанную профлавинс м с концентрацией 1,4 10 моль/л,- помещают в сосуд, добавляют 0,24 мл 5 10 моль/л раствора бензиламина, 0,24 мл Ь 10 моль/л тнрамина, 0,32 мл 5-10 моль/л серотонина. Добавляют 3,2 мл К-фосфатного буфера с РН 7,6 для доведения общего объема реакционной смеси до 5,0.

Концентрация серотонина в реакционной смеси 4-10 моль/л. Определение аналогично примеру 2.

Значение концентрации моноамина, найденное по градуировочной прямой,- 410 моль/л, что соответствует введенному количеству серотонина.

Пример 16. Ферментсодержащий препарат - желатиновую пленку с МАО активностью, обработанную профлавином с концентрацией I -1 0 моль/л,- помещают в сосуд для измеренш1 электрода с газовым зазором, добавляют 3,5 мл 0,15 моль/л раствора КС1 и 0,5 мл исследуемой крови человека. Измерительный сосуд закрывают, помещают в термостат при 40°(;, включают магнитную мещалку и 10 мин пропускают Од. без СО. Далее поток перекрывают и герметически закрытый сосуд

О

выдерживают 50 мин при 40 С с интен5

0

5

0

91

сивным перемешиванием. После инкубации ферментсодержащую пленку вынимают, в сосуд добавляют 1,4 г КС1, охлаждают сосуд до 25°С, закрывают пробкой со стеклянным рН-электродом, на поверхность ,которого помещена капля О,2%-ного раствора тритона Х-305 в бидистиллированной воде.Снова пропускают 0 без COj и затем через капилляр вводят в реакционную смесь 0,2 МП 1 моль/л NaOH (рН / 12) для полного освобождения аммиака. После установления постоянного потенциала (рН) (20 мин) на электроде запи сьшают показания потенциаометра (рН-метра/.

По градуировочной прямой находят значение концентрации серотонина (0,15 мкг/мл), соответствующее значению потенциала.

Пример 17. Ферментсодержащий препарат - пленку с МАО активностью,

обработанную профлавином с концентра цией f lO моль/л,- помещают в сосуд для измерений электрода с газовым за-

,зором, добавляют 0,24 мл 5-10 моль/л

-

бензиламина, 0,24 мл 5- 0 °моль/л ти- рамина, 0,32 ми 4-10 моль/л серотонина, 0,2 мл 5 -10 моль/л фенилэтил- амина. Добавляют 3,0 мп К-фосфатного буфера с РН 7,6. Концентрация серотонина в реакционной смеси 4 I f) моль/л. , Определение аналогично примеру 16.

18375 10

Значение концентрации серотонина, найденное по градуировочкой прямой, 4-10 моль/л, что соответствует введенному количеству.

Чувствительность способа 2 1 0 моль/л.

Интервал линейности калибровочного графика способа 2-10 2 -Ю моль/л,

10

15

20

25

30

35

Формула изобретенияСпособ количественного определения биогенных моноаминов путем их дезами- нирования при помощи ферментного препарата с моноаминооксидазной активностью с последующим потенциомет- рическим определением образовавшегося аммиака при помощи рН-злектрода, отличающийся тем, что, с целью расширения функциональных возможностей способа, упрощения и удешевления, определяют общее количества биогенных аминов при помощи фер- ментсодержащего препарата, выполненного в виде желатиновой; пленки с моноаминооксидазной активностью, причем суммарное количество тирамина и серотонина определяют при помощи ферментсодержащего препарата, обработанного профлавином с концентрацией (5-8) 1 О моль, а количество серотонина - при помощи фермент- содержащего препарата, обработанного профлавином с концентрацией (1,0 - 1,5) -10 моль.

Изобретение относится к физико-химическим методам анализа, в частности к потенциометрическому определению микроколичеств моноаминов в биологических средах и может быть использовано для клинического и токсикологического анализа в медицине и фармакологии. Целью изобретения является расширение функциональных возможностей способа, упрощение и удешевление. Определение общего количества биогенных моноаминов осуществляют при помощи ферментсодержащего препарата в виде желатиновой пленки с моноаминооксидазной активностью, причем суммарное количество тирамина и серотонина определяют при помощи ферментсодержащего препарата, обработанного профлавином с концентрацией (5-8)^.10^-4М, а количество серотонина - при помощи ферментсодержащего препарата, обработанного профлавином с концентрацией (1,0-1,5)^.10^-3М.