Способ определения кооперации гранулоцитов и моноцитов Советский патент 1991 года по МПК G01N33/53 

1

(21)4675072/14

(22)03.02.89

(46) 15.10.91. Бюл. №38

(71)Витебский медицинский институт

(72)Г.П.Адаменко (53)615.375(088.8)

(56)Аналогов в литературе не обнаружено. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КООПЕРАЦИИ ГРАНУЛОЦИТОВ И МОНОЦИТОВ

(57)Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано при оценке иммунного статуса в эвене гранулоцит-моноцит. Цель изобретения - определение кооперации грануло- цитов и моноцитов. Для достижения указанной цели используется капиллярный вариант реакции торможения миграции лейкоцитов из капиллярных трубок в присутствии моноцитов, при этом оценивают результат реакции через 6 ч и при повышении миграционной способности оценивают стимулирующее влияние моноцитов на гра- нулоциты. По изменению взаимоотношений в системе гранулоцит - моноцит можно определять иммунодефицитное состояние организма.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано в оценке иммунного статуса человека, а именно для выявления нарушений взаимодействия в звене моноцит-грануло- цит.

Целью изобретения является создание способа определения кооперации моноцитов и гранулоцитов.

Способ осуществляют следующим образом.

Гепаринизированную (20 ЕД/мл) венозную кровь в объеме 5-6 мл наслаивают на 2 мл раствора Фиколл-Гипак с плотностью 1,114 г/см3 и центрифугируют при 400 g 40 мин. Фракции мононуклеаров и гранулоцитов собирают отдельно и 3 раза отмывают изотоническим фосфатным буфером (ИФБ), рН 7,2, центрифугируя при 200 g 10 мин. Затем из осадка мононуклеаров приготавливают суспензию клеток 2x106 в мл на среде RPMI-1640 с 20%-нойинактивированной АВ (IV) сывороткой, 20 мМ глютамина и 100

мкг/мл гентамицина (КС). Суспензию в обь- еме 3 мл вносят в пластиковую чашку Петри и инкубируют при 37°С, 5%-нымС02 100%- ный влажности в течение часа. Неприлипшие клетки удаляют, прилипшие осторожно прополаскивают 3 раза средой 199 и инкубируют при 4°С в течение 20 мин в среде RPMI-1640 с 10 мМ ЭДТА. Отслоившиеся клетки собирают, отмывают 3 раза средой 199 и ресуспендируют до концентрации 1x10 в мл. Морфологическая (окраска по Романовскому - Гимза) и цитохимическая (неспецифическая экстераза) оценки показали, что эта суспензия клеток на 82-89% состоит из моноцитов.

Гранулоциты, полученные после центрифугирования крови в градиенте Фиколл-, Гипак, отмывают 3 раза ИФБ и ресуспендируют до концентрации 1х107 в мл в среде RPMI-1640. Морфологический анализ показал, что эта суспензия клеток на 96-97% состоит из гранулоцитов.

со

с

о

СО 4 О 00

Из осадка эритроцитов после 3 крашо- го отмывания ИФЬ готовя суспензию 1х106 в мл на среде RPMI -1640.

В ряд центрифужных пробирок вносят по 0,2 мл суспензии гранулоцитов. Затем в часть из них добавляют разные объемы (0,02-0,2 мл) суспензий моноцитов ил и эритроцитов, содержащих разные количества клеток. В остальные, вместо клеток, вносят среду RPMI 1640 Все пробирки центрифугируют при 200 g 5 мин, надосадочные жидкости удаляют. Осадки клеток ресуспендируют в 0,2 мл культуральной среды (КС). Полученными смесями клеток (моноциты и гранулоциты, или эритроциты и гранулоциты,или одни гранулоциты)заполняют капиллярные трубки (по 3 каждой смесью) длиной 1,5 см и диаметром 1,2 -1,4 мм, которые запаяны с одного конца. Затем капилляры с клетками помещают открытыми концами в ячейки 96-луночных кругло- донных планшет, в которые предварительно внесено по 0 1 мл КС. Планшеты закрывают крышкой и помещают в термостат при 37°С, 5%-ного С02 100%-ной влажности на 24 ч. Оценку реакции проводят через 1,3; 6: 12 и 24 ч по количеству клеток, вышедших из капилляров в среду ячейки, путем подсчета в камере Горяева. Показателем интенсивности миграции служит индекс миграции (ИМ), который высчитывают по формуле

где К - среднее число клеток, вышедших из 3 капилляров, содержащих гранулоциты с моноцитами или эритроцитами;

О - среднее число клеток, вышедших из 3 капилляров, содержащих гранулоциты.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью критерия Стьюдента.

Результаты. В процессе отработки предлагаемого метода оценки изменения миграции гранулоцитов под влиянием моноцитов были подобраны оптимальные концентрации взаимодействующих клеток. Гранулоциты были использованы в концентрации 1x10 в мл. которая согласно литературным данным является оптимальной в оценке миграции лейкоцитов. Индекс миграции (ИМ) одних гранулоцитов из капилляров был принят за 1. Количество моноцитов, необходимое для выполнения предлагаемого метода, было подобрано экспериментально. Оказалось, что моноциты в концентрации 1x10 в мл наиболее выражены (Р 0,05) стимулировали миграцию гранулоцитов. Морфологическая оценка

кпеток. мигрировавших из капилляров, показала, что 95 97% их являются гранулоци- Т9ми. Полученная стимуляция миграции гранулоцитов под влиянием моноцитов может быть вызвана пассивно, т.е. за счет механического присутствия клеток. Для проверки этого предположения вместо моноцитов к гранулоцитам добавляли эквивалентное количество эритроцитов. Из

0 результатов видно, что в отличие от моноцитов эритроциты в используемых концентрациях практически не изменяли миграцию гранулоцитов из капилляров. Следовательно, стимуляция миграции гранулоцитов мот

5 ноцитами не была связана с созданием ими механических помех, а обусловлена действием моноцитов.

В отличие от общепринятых методов, миграционную активность гранулоцитов

0 оценивали в динамике процесса миграции, что позволило дать оценку кинетике этого процесса. Результаты исследований показали, что уже через 3 ч моноциты значитель- но (Р 0,05) стимулируют миграцию

5 гранулоцитов, достигая максимального уровня через 6 ч. В дальнейшие сроки на- Е людения (до 24 ч) ИМ гранулоцитов снижался, но оставался достоверно больше (,05) ИМ гранулоцитов в отсутствие мо0 ноцитов.

Полученные результаты показали, что миграция гранулоцитов крови человека модулируется моноцитами в сторону стимуляции. Этот процесс обусловлен активным

5 Е заимодействием этих клеток, так как во- первых, миграционная активность гранулоцитов не изменяется под влиянием эритроцитов, и, во-вторых, стимуляция миграции гранулоцитов наступает после опре0 деленного времени культивирования взаимодействующих клеток.

Таким образом, способность моноцитов стимулировать миграцию гранулоцитов в капиллярном варианте реакции миграции

5 лейкоцитов можно использовать для более полной оценки иммунного статуса, а именно на уровне взаимодействия моноцитов и гранулоцитов. Таким способом можно выявить иммунодефицитные состояния, что позво0 лит проводить целенаправленную иммуно- корригирующую терапию.

Использование способа подтверждается примерами.

Пример 1. Донор станциии перели5 вания крови. При оценке иммунного статуса не выявлено отклонений от нормы (Т-лимфо- циты, 1,02х109 в мкл; В-лимфоциты О.ЗхЮ9 и мкп. Сывороточные иммуноглобулины: Джи- 12,Змг%,М- 1.03мг%,А-2,43мг%. Фагоцитоз: фагоцитарный индекс (ФИ)

63%, фагоцитарное число (ФЧ) 17. НСТ- тест: спонтанный -5,7%, стимулированный

-32,9%). Проведена оценка иммунного статуса на уровне взаимодействия моноцитов с гранулоцитами. Постановка реакции миграции лейкоцитов показала, что в присутствии моноцитов наблюдается стимуляция миграции гранулоцитов (ИМ 2,74). Полученные данные свидетельствуют о том, что в условиях нормального иммунного статуса у здоровых людей наблюдается стимуляция миграции гранулоцитов под влиянием моноцитов.

Пример 2. Больной К. с диагнозом; псориаз. На основании проведенных иммунологических исследований (Т-лимфоциты - 0,65хЮ9 в мкл; В-лимфоциты - 0,51хЮ9 в мкл. Сывороточные иммуноглобулины: Джи

-24,2 мг%, М - 0,87 мг%, А - 1,36 мг%. Фагоцитоз: ФЧ - 15, ФИ - 60,7%. НСТ-тест: спонтанный - 1,4%, стимулированный - 17,2%) выявлено нарушение иммунного статуса. Эти данные недостаточны для полной оценки иммунного статуса, так как не позволяют оценить его на уровне взаимодействия моноцитов с гранулоцитами. Такие исследования дают возможность более точно выявить иммунодефицитное состояние и назначить целенаправленную иммунокор- ригирующую терапию. Постановка реакции миграции лейкоцитов у данного больного показала, что в присутствии моноцитов стимуляция миграции гранулоцитов (ИМ - 1,62) снижена на 40,8% по сравнению с данными, полученными в примере 1. Следовательно, выполненные исследования свидетельствуют о иммунодефиците в звене моноцит - гранулоцит у больного К., что указывает на необходимость проведения целенаправленной иммунокорригирующей терапии.

Пример 3. Больной В. с диагнозом: экзема. На основании проведенных иммун- нологических исследований (Т-лимфоциты 1,23хЮ9 в мкл; В-лимфоциты - 0,29хЮ9 в мкл. Сывороточные иммуноглобулины: Джи

-14,7 мг%. М - 1,04 мг%0 А - 2,97 мг%. Фагоцитоз: ФЧ - 12,2; ФИ - 53,4%. НСТ- тест: спонтанный-4,8%, стимулированный

-40,7%)не выявлено изменений иммунного статуса. Для полной его оценки исследовано взаимодействие моноцитов с гранулоцитами в реакции миграции лейкоцитов. Обнаружено, что в присутствии моноцитов наблюдается стимуляция миграции гранулоцитов (ИМ 4.34). которая на 58,4% выше стимуляции миграции гранулоцитов под влиянием моноцитов, полученной в примере 1, и намного выше данных, полученных в примере 2. На основании этого можно констатировать, что у больного В. при отсутствии нарушений в иммунном статусе, по данным общепризнанной оценки, выявлено

иммунодефицитное состояние в звене моноцит -гранулоцит. что указывает на необходимость назначения соответствующей иммунокорригирующей терапии.

Таким образом, приведенные клинические примеры показывают, что предлагаемый способ оценки иммунного статуса позволяет более полно обнаружить нарушения в иммунной системе организма, что является важным для проведения

иммунокорригирующей терапии.

Преимущества предлагаемого способа: 1. Впервые в реакции миграции лейкоцитов показана стимуляция миграции гранулоцитов под влиянием моноцитов.

оценку иммунного статуса, что важно в практическом здравоохранении для выявления иммунодефицитных состояний и проведения адекватной иммунокорригирующей терапии.

Формула изобретения

Способ определения кооперации гранулоцитов и моноцитов путем постановки реакции миграции лейкоцитов в капиллярах в присутствии моноцитов и при повышении

миграционной способности определяют стимулирующее влияние моноцитов на гранул оциты.