Способ получения оптически активных L-аминокислот Советский патент 1991 года по МПК C07C227/34 

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения оптически активных L-аминокислот, которые могут использоваться в химической, медицинской, пищевой промышленности.

Цель изобретения - повышение выхода и качества целевого продукта, а также упрощение процесса.

П р и м е р 1. Получение L-валина.

Первый цикл получения L-валина.

В трехлитровый сосуд, снабженный магнитной мешалкой, помещают 127,4 г (0,8 моль) №-аце™л-0 --вап лна и 1,487 л воды. Включают мешалку, подогревают содержимое сосуда до 40°С и порциями добавляют 5 н. водный раствор едкого натра до получения рН смеси 7,2. Затем добавляют двуххлористый шестиводный кобальт в количестве 7,5 х моль Со и сосуд переносят в термостат с температурой 50°С. В литровой колбе в минимальном обьеме воды растворяют 550 мг ферментного препарата аминоацилазы с удельной активностью 390 ед./r, добавляют к содержимому сосуда и осуществляют энантиоселективный гидролиз N-aцeтил-DL-вaлинa в течение 24 ч. рН реакционной смеси поддерживают равным 7,2 добавлением 2 н. раствора едкого натра.

о

00

ел о

ю -N

После 10 ч гидролиза добавляют еще 250 мг ферментного препарата и продолжают гидролиз. Через 24 ч гидролиза температуру реакционной массы поднимают до 60°С и при этой температуре выдерживают 1 ч.

Конец реакции определяют наличием теоретического количества L-валина в расчете на г -ацетил-1 -валин в реакционной смеси методом, основанным на нингидриновой реакции. После завершения энантиоселективного гидролиза М-ацетил-01-валина содержимое сосуда переносят в круглодонную колбу объемом 3 л, снабженную мешалкой и термометром, и при перемешивании добавляют уксусную кислоту до получения рН реакционной смеси 5,0. Затем содержимое колбы нагревают до 80°С и подвергают очистке активированным углем. Уголь отделяют на воронке Бюхнера.

Фильтрат концентрируют на роторном испарителе до появления кристаллов.

Выпавшие кристаллы L-валина отделяют на воронке Бюхнера и на фильтре промывают минимальным объемом 80%-ного изопропилового спирта. L-Валин высушивают в сушильном шкафу при 60-70°С, получая 32,5 г L-валина с содержанием

основного вещества 99,5%; +27° (с 1;5н. HCI).

Маточный раствор, содержащий М-аце- тил-0-валин, подвергают рацемизации.

Промывной изопропиловый спирт подвергают отгонке, спирт используют повторно для той же цели, а остаток объединяют с остатками, полученными при отгонке спиртов второго, третьего и четвертого циклов гидролиза, и подвергают рацемизации.

Первый цикл рацемизации М-ацетил-0- валина.

Маточный раствор, содержащий М-аце- тил-0-валин, переносят в четырехгорлую колбу объемом 1 л, снабженную мешалкой, термометром, обратным холодильником и капельной воронкой. Пускают в ход мешалку, добавляют 2,94 моль уксусного ангидрида и при подогревании осуществляют рацемизацию М-ацетил-О-валина в М-аце- TM-DL-BannH. Полноту рацемизации определяют на поляриметре А-1-ЕПО измерением угла вращения реакционной смеси, После полной рацемизации содержимое колбы упаривают на роторном испарителе до прекращения отгона, Осадок растворяют в ми- нимильном количестве воды и воду упаривают в тех же условиях. Осадок повторно растворяют в дистиллированной воде, переносят в трехгорлую круглодонную колбу емкостью 0,5 л, снабженную мешал0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

кой, термометром и капельной воронкой, пускают в ход мешалку и при 20°С прибавляют соляную кислоту до получения рН смеси 1,7.

Выпавшие кристаллы М-ацетилЧ Х-вали- на фильтруют на воронке Бюхнера, получая 69,0 г влажного технического М-ацетил-0L-валина, содержащего не более 20% влаги.

Второй цикл получения L-валина.

69,0 г влажного технического М-ацетил- DL-валина помещают в двухлитровый сосуд, снабженный магнитной мешалкой, добавляют 0,744 л дистиллированной воды, пускают в ход мешалку и при 40°С добавляют 5 н. водный раствор едкого натра до получения рН смеси 7.2, а затем добавляют двуххлори- стый шестиводный кобальт до получения содержания Со + 7,5 х 10 моль. Сосуд переносят в термостат, поднимают температуру до 50°С. В однолитровой колбе растворяют 500 мг ферментного препарата аминоацилэзы в минимальном объеме воды, добавляют к содержимому сосуда и осуществляют энантиоселективный гидролиз N-aцeтил-DL-вaлинa. После 10 ч гидролиза добавляют еще 150 мг ферментного препарата и продолжают гидролиз еще 14 ч„

Подкисление реакционной смеси, ее очистку углем, концентрирование, выделение L-валина, его промывку 80%-ным изо- пропиловым спиртом и сушку осуществляют аналогично первому циклу получения L-валина,

Получают 15,0 г L-валина с содержанием основного вещества 99,1 %, +27° (с 1;5н. HCI).

Второй цикл рацемизации М-ацетил-О- валина.

Маточный раствор, содержащий М-аце- тил-0-валин, полученный после выделения L-валина второго цикла, переносят в четырехгорлую круглодонную колбу 0,5 л, снабженную мешалкой, термометром, обратным холодильником и капельной воронкой, пускают в ход мешалку и прибавляют 1,26 моль уксусного ангидрида, Рацемизацию М-ацетил-О-валина в М-ацетил-ОЬ-валин, упарку растворителя, промывание осадка, его растворение в воде и выделение Г. uHcinn-DL- валина осуществляют как в первом цикле рацемизации.

Получают 27,0 г влажного технического N-aцeтил-DL-вaлинa с содержанием влаги не более 20%.

Третий цикл получения L-валина.

27,0 г влажного технического М-ацетил- DL-валина, полученного после второго цикла рацемизации М-ацетил-О-валина, растворяют в 400 мл дистиллированной воды. содержащей 7,5 х моль Со4. рН раствора доводят до 7,2 с помощью 5 н. водного раствора едкого натра. Добавляют 200 мг ферментного препарата аминоацила- зы, растворенной в минимальном обьеме воды, и осуществляют энантиоселективный гидролиз при 50°С и рН 7,2.

После 10 ч гидролиза добавляют еще 100 мг ферментного препарата и продолжают гидролиз еще 14 ч.

Определение полноты гидролиза, под- кисление реакционной смеси, ее очистку углем и концентрирование, выделение L-валина, его промывку 80%-ным изопропи- ловым спиртом и сушку осуществляют аналогично первому циклу получения L-валина.

Получают 6,2 г L-валина с содержанием

основного вещества 99.1%: +27° (с- 1;5н. HCI).

Третий цикл рацемизации М-ацетил-D- валина.

Маточный раствор, содержащий М-аце- тил-0-валин, оставшийся после третьего цикла получения L-валина, подвергают рацемизации 0,55 моль уксусного ангидрида аналогично первому циклу рацемизации N- ацетил-О-валина.

Получают 8,0 г влажного технического N-a4eTHfl-DL-eaflHHa с содержанием влаги не более 20%.

Четвертый цикл получения L-валина.

Четвертый цикл получения L-валина осуществляют аналогично первому циклу получения L-валина, но при другом количестве реагентов: влажный М-ацетилЧ -валин 8 г, дистиллированная вода 280 мл; ферментный препарат аминоацилазы 150мг.

Получают 2,0 г L-валина с содержанием

основного вещества 99,2%: +27° (с 1;5н. HCI).

Четвертый цикл рацемизации М-ацетил- D-валина.

Четвертый цикл рацемизации М-ацетил- D-валина проводят аналогично первому циклу рацемизации N-ацетил-О-валина, но маточный раствор, образованный после четвертого цикла получения L-валина, объединяют с остатками первого, второго, третьего и четвертого циклов, полученных после удаления изопропилового спирта и рацемизи- руют в указанных условиях, с помощью 0,19 моль уксусного ангидрида.

Получают 8,2 г технического влажного М-ацетилЧ1 -валина с содержанием влаги не более 20%.

Пятый цикл получения L-валина.

Пятый цикл получения L-валина осуществляют аналогично четвертому циклу получения L-валина.

Получают 2,2 г L вэлиня с содержанием основного вещества 99.1%: 27П (с 1;5н. HCI).

Таким образом, поте пяти циклов гид- ролиза М-ацетил-Dl.-валима получают 57.5 г валина, что составляет 61,6% от теоретического в расчете на M-a40Tnn-DL-Banmi. Содержание основного вещества 99.1%;

О tа &° +27° с 1 5н. Н CI). Продукт хрома- тографически однороден.

Найдено, %: С 51,26; Н 9,50; N 11,95.

C5HnN02

Вычислено, %: 051,26; Н 9,47; N 11,96. 5П р и м е р 2. Получение L-фенилаланина.

Процесс проводят аналогично примеру 1, но в качестве субстрата используют N-aцeтил-DL-фeнилaлaнин, энантиоселек- Q тивный гидролиз осуществляют при рН 7,6 в течение 30 ч. Рацемизироианную ацетила- минокислоту осаждают при рН 1,5.

Первый цикл получения L-фенилалани- на.

5 Исходный продукт, растворенный в 2,240 л воды, содержащий 7,5 х моль Со4 и 800 мг ферментного препарата аминоацилазы, подвергают гидролизу при 50°С и рН 7,6 в течение 10 ч. Затем прибавляют о еще 300 мг ферментного препарата и продолжают гидролиз 19 ч. Поднимают температуру до 60°С и выдерживают 1 ч.

Получают 27,5 г L-фенилаланина с содержанием основного вещества 99,3%;

5 -35°(с 1;Н20).

Первый цикл рацемизации М-ацетил-D- фенилаланина.

N-Ацетил-О-фенилаланин в маточном растворе подвергаютрацемизации воздей- 0 ствием 1,68 моль уксусного ангидрида.

Рацемизованный М-ацетил-01 -фени- лаланин осаждают соляной кислотой при рН 1,5,

Получают 80,9 г технического М-ацетил- 5 DL-фенилаланина с содержанием влаги не более 15%.

Второй цикл получения L-фенилаланина.

80,0 г технического N-a4eTHfl-DL eHH- 0 лаланина подвергают энантиоселективному гидролизу с помощью 650 мг ферментного препарата аминоацилазы: сначала прибавляют 450 мг, а затем, после 10ч гидролиза, - 200 мг.

5 Получают 17,5 г L-фенилаланина с содержанием основного вещества 99.1%; aft° -350(c-1;H20).

Второй цикл рацемизации М-ацетил-D- фенилаланина.

Ы-Ацетил-О-фенилалэнин в маточном растворе, остающийся после второго цикла получения L-фениалаМина, рацемизуют с помощью 0,68 моль уксусного ангидрида.

Получают 41,0 г влажного технического ацетил-01 -фенилаланина с содержанием влаги не более 15%.

Третий цикл получения L-фенилала- нина.

41,0 г технического влажного М-ацетил- DL фенилаланина подвергают энантиосе- лективному гидролизу с помощью 325 мг ферментного препарата аминоацилазы: сначала добавляют 225 мг, а затем, после 10 ч гидролиза, - 100 мг.

Получают 8,0 г L-фенилаланина с содержанием основного вещества 99,6%; -35°(с 1; Н20).

Третий цикл рацемизации N-эцетил-О- фенилаланина.

N-Ацетил-О-фенилаланин в маточном растворе, оставшийся после третьего цикла получения L-фенилаланина, рацемизуют взаимодействием с 0,4 моль уксусного ангидрида.

Получают 22,0 г технического влажного М-ацетил-ОЬфенилаланина с содержанием влаги не более 15%.

Четвертый цикл получения L-фенилаланина.

22,0 г технического влажного М-ацетил- DL-фенилаланина подвергают энантиосе- лективному гидролизу с помощью 210 мг ферментного препарата аминоацилазы; сначала прибавляют 125 мг, а затем, после 10 ч гидролиза, - 85 г.

Получают 5,07 г L-фенилаланина с содержанием основного вещества 99,1%;

а &°--35°(с-1; Н20).

Четвертый цикл рацемизации N-ацетил- D-фенилаланина.

N-Ацетил-О-фенилаланин в маточном растворе, оставшемся после четвертого цикла получения L-фенилаланина, объединяют с остатками, полученными после удаления изо- пропилового спирта, и подвергают рацемизации воздействием 0,31 моль уксусного ч гидрида.

Получают 16 г технического N-ацетил- DL-фенилаланина с содержанием влаги не более 15%.

Пятый цикл гидролиза L-фенилаланина.

16 г технического N-aцeтил-DL-фeнилa- ланина подвергают энантиоселективному гидролизу с помощью 158 мг ферментного препарата аминоацилазы: сначала прибавляют 125 мг, а затем, после 10 ч гидролиза, - 33 мг препарата,

Получают 3,1 г L-фенилаланина с содержанием основного вещества 99,2%, affi -35° (с 1; Н20).

Таким образом, после пяти циклов пол- учают 61,2 г L-фенилаланина, что составляет 61,7% от теоретического в расчете на N-аце- тил-DL-фeнилaлaнин. Содержание основного вещества 99,2 %; а &° -35° (с 1; Н20). Продукт хроматографически однороден.

Найдено, %: С 65,77; Н 6,43; N 8,56. - CgHnN02

Вычислено, %: С 65,44; Н 6,7; N 8,48.

Примерз. Получение L neuunHa. Процесс проводят аналогично примеру 1, но в качестве ацетиламинокислоты берут N-a4eTHfl-DL-fleu4HH, энантиоселективный гидролиз осуществляют при рН 7,8 в течение 28 ч. Первый цикл получения L-лейцина,

173,21 г (1 моль) N-anewn-DL-nefiuwa растворяют в 2,8 л воды, содержащей 7,5 х моль кобальта, добавляют 1,5 г ферментного препарата аминоацилазы и ПРИ РН 7,8 и 50°С осуществляют энантиоселективный гидролиз в течение 14 ч. Затем добавляют еще 0,5 г ферментного препарата и продолжают гидролиз еще 13 ч, поднимают температуру до 60°С и выдерживают при этой температуре 1 ч.

Получают 45,9 г L-лейцина с содержанием основного вещества 99,3%; а Ь0-+15° (с 1;5н. HCI).

Первый цикл рацемизации М-ацетил-D- лейцина.

N-Ацетил-О-лейцин в маточном растворе, оставшийся после первого цикла выделения L-лейцина, рацемизуют воздействием 3,17 моль уксусного ангидрида. Рацемизо- ванный М-ацетил-ОЬ-лейцин осаждают при рН 1,7 соляной кислотой.

Получают 103 г технического N-ацетил- DL-лейцина с содержанием влаги не более 20%. Второй цикл получения L-лейцина.

103 г влажного технического N-ацетил- DL-лейцина подвергают энантиоселективному гидролизу с помощью 1,0 г ферментного препарата аь .и о&цилазы. Сначала прибавляют 750 мг препарата, а после 15-часового гидролиза, - еще 250 мг.

Получают 23,4 г L-лейцина с содержанием основного вещества 99,1%; +15° (с- 1;5н. HCI).

Второй цикл рацемизации N-ацетил-О- лейцина. N-ацетил-О-лейцин в маточном растворе, оставшийся после второго цикла получения L-лейцина, рацемизуют с помощью 1,57 моль уксусного ангидрида.

Получают 49 г технического N-ацетил- DL-лейцина с содержанием влаги не более 20%.

Третий цикл получения L-лейцина.

49 г технического влажного М-ацетил-DL- лейцина подвергают энантиоселективному гидролизу с помощью 500 мг ферментного препарата аминоацилазы: сначала прибавляют 375 мг, а затем после 15 ч гидролиза. - 125 мг.

Получают 11,9 г L-лейцина с содержанием основного вещества 99,2%; +15° (. HCI).

Третий цикл рацемизации М-ацетил-D- лейцина.

N-Ацетил-О-лейцин в маточном растворе, оставшийся после третьего цикла получения L-лейцина, рацемизуют с помощью 0,78 моль уксусного ангидрида.

Получают 25 г технического N-ацетил- DL-лейцина с содержанием влаги не более 20%.

Четвертый цикл получения L-лейцина.

25 г технического влажного М-ацетил- DL-лейцина подвергают энантиоселектив- ному гидролизу с помощью 250 мг ферментного препарата аминоацилазы: сначала прибавляют 180 мг, а затем, после 15 ч гидролиза, - 70 мг продукта. Получают 5,8 г L-лейцина с содержанием основного

вещества99,1 +15°(с- 1; 5н. HCI).

Четвертый цикл рацемизации N-ацетил- D-лейцина.

М-Ацетил-О-лейцин в маточном раство- ре, оставшийся после четвертого цикла получения L-лейцина, объединяют с остатками, образовавшимися после упаривания изо- пропиловосо спирта, и подвергают рацемизации воздействием 0,78 моль уксусного ангидрида.

Получают 25 г технического N-ацетил- DL-лейцина с содержанием влаги не более 20%.

Пятый цикл получения L-лейцина.

25 г технического влажного М-ацетил- DL-лейцина подвергают энантиоселективному гидролизу с помощью 250 мг ферментного препарата аминоацилазы: сначала прибавляют 180 мг, а затем, после 15ч гидролиза, - 70 мг продукта.

Получают 5,3 г L-лейцина с содержанием основного вещества 99,2%; (с-1;5н. HCI).

Таким образом, после пяти циклов гидролиза N-a4e™n-DL-fleu4MHa получают 92,3 г L-лейцина, что составляет 70.4% от теоретического в расчете на М-ацетил-DL- лейцин. Содержание основного вещества

5 0

О

5

5 0

5

о

5

0

-оставляет 99,3%; - И5° (с - 1. 5н. HCI). Продукт хроматографически гомогенен.

Найдено, %: С 54.68: Н 10.21: N 10.53

СбЖзМ02

Вычислено, %: С 54,94; Н 9,99; N 10,68.

П р и м е р 4. Получение L-метионина.

Процесс проводят аналогично примеру 1, но в качестве субстрата берут М-ацетил- DL-метионин, энантиосепективный гидролиз осуществляют при рН 7,8 в течение 32 ч, рацемизованный N-ацeтил-DL-мeтиoнин выделяют из воды кристаллизацией, после ионообменной очистки.

Первый цикл получения L-метионина.

57.4г (0,3 моль) N-aцeтил-DL-мeтиoни- на, растворенного в 836 мл дистиллированной воды, содержащей 7.5 х 10 моль кобальта и 330 мг ферментного препарата аминоацилазы, подвергают энантиоселективному гидролизу при 50°С и рН 7,8 в течение 17 ч. Затем добавляют 120 мг ферментного препарата и продолжают гидролиз еще 14 ч. В конце поднимают температуру до 60°С и выдерживают при этой температуре 1 ч.

Получают 12,3 г L-метионина с содержанием основного вещества 99,1%; +23°(с 2;5н. HCI).

Первый цикл рацемизации М-ацетил-D- метионина.

N-Ацетил-О-метионин в маточном растворе, оставшемся после выделения L-метионина, подвергают рацемизации воздействием 0,48 моль уксусного ангидрида. Реакционную смесь, содержащую N- aneTnn-DL-MeTHOHHH, упаривают на роторном-испарителе до прекращения отгона. Осадок растворяют в минимальном объеме воды и переносят в стакан, емкостью 1 л, снабженный магнитной мешалкой, добавляют 250 г влажной ионообменной смолы КУ-2 х 8 в Н-норме и перемешивают в течение Т ч.

Смолу отделяют на воронке Бюхнера, промывают водой (3 х 100 мл). Промывные воды соединяют с фильтратом и объединенный водный раствор N-aцeтил-DL-мeтиoни- на концентрируют на роторном испарителе при 55°С до появления кристаллов, затем выдерживают при 5°С в течение 4 ч. Кристаллы отделяют на воронке Бюхнера.

Получают 40,5 г влажного технического . продукта с содержанием влаги не более 20%.

Второй цикл получения L-метионина.

40.5г влажного технического М-ацетил- DL-метионина подвергают энантиоселективному гидролизу с помощью 250 мг

ферментного препарата аминоацилазы. Сначала прибавляют 180 мг препарата, а затем, после 17 ч гидролиза, - 70 мг, и гидролиз продолжают еще 14 ч.

Получают 7,8 г L-метионинэ с содержанием основного вещества 99,1%; а) +23,5°(с 2;5н. HCI).

Второй цикл рацемизации М-ацетил-D- метионина.

N-Ацетил-О-метионин в маточном растворе, оставшийся после второго цикла пол- учения L-метионина, рацемизуют с помощью 0,26 моль уксусного ангидрида, М-Ацетил-01 -метионин подвергают ионообменной очистке, как в первом цикле рацемизации N-ацетил-О-метионина.

Получают 23,8 г влажного технического продукта с содержанием влаги не более 20%.

Третий цикл получения L-метионина.

23,8 г влажного технического N-ацетил- DL-метионина подвергают энантиоселек- тивному гидролизу с помощью 120 Mr- ферментного препарата аминоацилазы. Сначала добавляют 80 мг, а затем, после 18 ч гидролиза, - 40 мг препарата и гидролиз продолжают еще 14 ч,

Получают 4,0 г L-метионина с содержанием основного вещества 99,2%; +23°(с 2;5н. HCI).

Третий цикл рацемизации М-ацетил-О- метионина,

N-Ацетил-О-метионин в маточном растворе, оставшийся после третьего цикла получения L-метионйна, рацемизуют с помощью 0,14 моль уксусного ангидрида. М-Ацетил-DL- метионин подвергают ионообменной очистке как описано.

Получают 14 г технического влажного N-a4eTHfl-DL-MeTHOHHHa с содержанием влаги не более 20%.

Четвертый цикл получения L-метионина.

14 г влажного технического М-ацетил- DL-метионина подвергают знантиоселек- тивному гидролизу с помощью 60 мг ферментного препарата аминоацилазы. Сначала прибавляют 40 мг препарата, а затем, после 17 ч гидролиза, - 20 мг и гидролиз продолжают еще 14 ч.

Получают 2,1 г L-метионина с содержанием основного вещества 99,1%; -+24°(с 2;5н.НС1).

Четвертый цикл рацемизации М-ацетил- О-метионина.

N-Ацетил-О-метионин в маточном растворе, оставшийся после четвертого цикла получения L-метионина, объединяют с остатками, полученными после упаривания

изопропилового спирта и подвергают рацемизации с помощью 0.108 моль уксусного ангидрида. N-A4emfl-DL-Me™OHHH подвергают ионообменной очистке как описано. Получают 12 г технического влажного

N-a4eTHfl-DL-MeTHOHHHa с содержанием влаги не более 20%.

Пятый цикл получения L-метионина.

12,0 г технического влажного N-ацетил- DL-метионина подвергают энантиоселек- тивному гидролизу с помощью 50 мг ферментного препарата аминоацилазы. Сначала прибавляют 35 мг препарата, а затем, после 17ч гидролиза, - 15 мг и продол- жают гидролиз еще 15 ч.

Получают 2,0 г N-метионина с содержанием основного вещества 99,1%; +24°(с-2;5н. HCI).

Таким образом, после пяти циклов гидролиза N-a4eTwi-DL-Me™oHHHa получают

28,0 г L-метионина, что составляет 62,4% от

теоретического в расчете на М-ацетил-DLметионин. Содержание основного вещества

составляет 99,1%; afe° +23,5° (с - 2; 5н. HCI). Продукт хроматографически гомогенен.

Найдено, %: С 40,55; Н 7,58; N 9,60; S21.5.

C5HnN02S

Вычислено, %; С 40,25; Н 7,43; N 9,38; 521,49.

П р и м е р 5. Получение L- а -аланина.

Процесс проводят аналогично примеру 1, но в качестве субстрата берут М-ацетил- DL-аланин, энантиоселективный гидролиз осуществляют в течение 33 ч, рацемизован- ный N-aцeтил-DL-aлaнин выделяют из воды кристаллизацией после ионообменной очисткиПервый цикл получения L- а -аланина.

39,4 г (0,3 моль) М-ацетил-ОЬ-аланина растворенного в 840 мл дистиллированной воды, содержащей 75 х моль кобальта и

330мг ферментного препарата аминоацилазы, подвергают энантиоселективному гидролизу при 50°С и рН 7,2 в течение 17 ч. Затем добавляют 120 мг ферментного препарата и продолжают гидролиз еще 15 ч.

Поднимают температуру до и выдерживают при этой темперауре 1 ч.

Получают 7,5 г L- а -аланина с содержанием основного вещества 99,1%; +13° (с 5, 1н. HCI).

Первый рацемизации М-ацетил-D- аланина.

М-Ацетил-О-аланин в маточном растворе подвергают рацемизации с помощью 0,95 моль уксусного ангидрида.

Реакционную смесь, содержащую N- ацетил-01 -аланин, упаривают на роторном испарителе до прекращения выделения отгона. Остаток растворяют в дистиллированной воде и переносят в стакан емкостью 1 л, снабженный магнитной мешалкой, добавляют 300 г влажного катионита КУ-2 х 8 в Н-форме и перемешивают в течение 1 ч. Смолу отделяют на воронке Бюхнера, промывают водой (3 х 100 мл). Объединенный водный раствор М-ацетил-0 -аланина и промывные воды концентрируют на роторном испарителе до появления кристаллов, затем выдерживают при 2°С в течение 4 ч. Кристаллы отделяют на воронке Бюхнера.

Получают 24 г технического N-ацетил- DL-аланина с содержанием влаги не более 20%.

Второй цикл получения L-a-алэнина.

24 г влажного технического М-ацетил-DL- аланина подвергают энантиоселективному гидролизу с помощью 280 мг ферментного препарата аминоацилазы: сначала добавляют 180 мг, а затем, после 17ч гидролиза, - 100 мг и гидролиз продолжают еще 15 ч.

Получают 4,0 г L-a-аланина с содержанием основного вещества 99,1%; +13° (с 5; 1н. HCI).

Второй цикл рацемизации N-ацетил-О- аланина.

N-Ацетил-О-аланин в маточном растворе, оставшемся после второго цикла получения L-a-аланина, рацемизуют с помощью 0,4 моль уксусного ангидрида. М-Ацетил-DL- аланин подвергают ионообменной очистке и выделению как в первом цикле рацемизации М-ацетил-О-аланина.

Получают 11,2 г технического N-ацетил- DL-аланина с содержанием влажности не более 20%.

Третий цикл гидролиза L-a-аланина.

11,2 г технического влажного N-ацетил- DL-аланина подвергают энантиоселективному гидролизу с помощью 150 мг ферментного препарата аминоацилазы: сначала прибавляют 100 мг, а затем, после 17ч гидролиза, - 50 мг и гидролиз продолжают еще 15ч.

Получают 2,0 г L-a-аланина с содержанием основного вещества 99,2%; +14° (с 5, 1н. HCI).

Третий цикл рацемизации N-ацетил-О- аланина.

М-Ацетил-О-аланин в маточном растворе, оставшемся после третьего цикла получения L-a-аланина, подвергают рацемизации с помощью уксусного ангидрида, М-Ацетил-DL- аланин подвергают ионообменной очистке и выделению как описано.

Получают 6,0 г технического N-ацетил- DL-аланина с содержанием влаги не более 20%.

Четвертый цикл получения L-a-аланина 6,0 г влажного технического М-ацетил-DLаланина подвергают энантиоселективному гидролизу с помощью 70 мг ферментного препарата аминоацилазы; сначала прибавляют 50 мг, а затем, после 17 ч гидролиза, - 20 мг препарата и гидролиз продолжают еще 15 ч.

Получают 1,1 г L-a-аланина с содержанием основного вещества 99,1%, 13,5° (с-5; 1н. HCI).

Четвертый цикл рацемизации М-ацетил- О-аланина.

N-Ацетил-О-аланин в маточном растворе, оставшемся после четвертого цикла получения L-a-аланина, объединяют с остатками, полученными после упаривания изопропилового спирта, и подвергают рацемизации с помощью 0,63 моль уксусного ангидрида. М-Ацетил-О-аланин подвергают ионообменной очистке и выделению как описано.

Получают 9,1 г технического М-ацетил- DL-аланина с влажностью не менее 20%.

Пятый цикл получения L-a -аланина.

9,1 г влажного технического М-ацетил- DL-аланина подвергают энантиоселективному гидролизу с помощью 120 мг ферментного препарата аминоацилазы: сначала прибавляют 80 мг, а затем, после 17 ч гидролиза, - 40 мг препарата и продолжают гидролиз еще 15 ч.

Получают 1,5 г L- a-аланина с содержанием основного вещества 99,2%; +14° (с 5; 1н. HCI).

Таким образом, после пяти циклов получают 16,1 г L-аланина, что составляет 60,0% от теоретического в расчете на М-аце- Twi-DL-aflaHHH. Содержание основного вещества составляет 99,1%; а$° - +15,5° (с 5; 1н. HCI). Продукт хроматографически гомогенен.

Найдено, %: С 40,22; Н 8,09; N 15.64.

СзН7М02

Вычислено, %: С 40,45; Н 7,92; N 15.72. П р и м е р 6. Получение L-фенилглицина.

Процесс проводят аналогично примеру 1, но в качестве субстрата берут М-аце- тил-ОЬ-фенил глицин, энантиоселективный гидролиз осуществляют при рН 6,7 в течение 35 ч, Ьфе- нилглицин на фильтре промывают водой Промывные воды, образованные на 1-4 циклах гидролиза объединяют.концентрируют в вакууме, присоединяют к маточному раствору четвертого цикла L-Фечилглицина и подвергают рацемизации.

Первый цикл получения L-фенилгли- цина.

58,0 г (0,3 моль) М-ацетил-ОЬфенилала- нина, растворенного в 800 мл дистиллированной воды, содержащей 7,5 х 105 моль кобальта и 1,5 г ферментного препарата аминоацилазы, подвергают энантиоселек- тивному гидролизу при рН 6,7 и 50°С в течение 20 ч. Затем прибавляют 1,0 г ферментного препарата и продолжают гидролиз еще 14ч. Затем поднимают температуру до 60°С и выдерживают при этой температуре 1 ч, L-Фенилглицин на фильтре промывают дистиллированной водой.

Получают 12 г L-фенилглицина с содержанием основного вещества 99,1%; «Й° +154° (с 1,4; 1н. HCI).

Первый цикл рацемизации М-ацетил-D- фенилглицина.

N-Ацетил-О-фенилглицин в маточном растворе подвергают рацемизации с помощью 0,65 моль уксусного ангидрида.

Реакционную смесь, содержащую N- ацетил-О1 -фенилглицин упаривают в вакууме до прекращения выделения отгона. Остаток растворяют в минимальном объеме дистиллированной воды и порциями добавляют концентрированную соляную кислоту до получения рН 1,7. Смесь выдерживают при 5°С в течение 3 ч. Выпавшие кристаллы фильтруют на воронке Бюхнера.

Получают 32 г технического М-ацетил- DL-фенилглицина с содержанием влаги не более 20%.

Второй цикл получения L-фенилглицина.

32 г влажного технического N-ацетил- DL-фенилглицина подвергают энантиосе- лективному гидролизу с помощью 1,25 г ферментного препарата аминоацилазы; сначала прибавляют 800 мг, а затем, после 20 ч гидролиза, - 450 мг препарата и продолжают гидролиз еще 15 ч.

Получают 6,6 г L-фенилглицина с содержанием основного вещества 99,1%; +154°(с 1,4; 1н. HCI).

Второй цикл рацемизации М-ацетил-D- фрнилглицина.

N-Ацетил-О-фенилглицин в маточном растворе, оставшемся после второго цикла получения L-фенилглицина, рацемизуют с помощью 0,35 моль уксусного ангидрида.

Получают 18 г технического М-ацетил- DL-фенилглицина с содержанием влаги не более 20%.

Третий цикл получения L-фенилглицина.

18 г влажного технического N-ацетил- DL-фенилглицина подвергают энантиосе0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

лективному гидролизу с помощью 600 мг ферментного препарата аминоацилазы: сначала прибавляют 400 мг, а затем, после 20 ч гидролиза, - 200 мг препарата и гидролиз продолжают еще 15 ч.

Получают 3,5 г L-фенилглицина с содержанием основного вещества 99,2%; -+154°(,4;5н. HCI).

Третий цикл рацемизации М-ацетил-D- фенилглицина.

М-Ацетил-О-фенилглицин в маточном растворе, оставшемся посте третьего цикла получения L-фенилглицина, подвергают рацемизации с помощью 0,2 моль уксусного ангидрида.

Получают 10 г технического М-ацетил- DL-фенилглицина с содержанием влаги не более 20%.

Четвертый цикл получения L-фенилглицина.

10 г влажного технического N-ацетил- DL-фенилглицина подвергают энантиосе- лективному гидролизу с помощью 250 мг ферментного препарата аминоацилазы: сначала прибавляют 170 мг, а затем, после 20 ч гидролиза, - 80 мг препарата и гидролиз продолжают еще 15ч.

Получают 2,0 г L-фенилглицина с содержанием основного вещества 99,0%; +154° (с 1,4; 1н. HCI).

Четвертый цикл рацемизации N-ацетил- D-фенилглицина.

1М-Ацетил-0-фенилглицин в маточном растворе, оставшемся после четвертого цикла получения L-фенилглицина, объединяют с промывными водами образованными на 1-4 циклах и подвергают рацемизации с помощью 0,36 моль уксусного ангидрида.

Получают 24 г технического М-ацетил- DL-фенилглицина с содержанием влаги не более 20%.

Пятый цикл получения L-фенилглицина.

24 г влажного технического N-ацетил- DL-фенилглицина подвергают энантиосе- лективному гидролизу с помощью 700 мг ферментного препарата аминоацилазы: сначала прибавляют 500 мг, а затем, после 20 ч гидролиза, - 200 мг препарата и продолжают гидролиз еще 15 ч.

Получают 3,1 L-фенилглицина с содержанием основного вещества 99,0%; +154° (с 1,4; 1н. HCI).

Таким обрэзгм, после пяти циклов получают 27,2 г L-фенилглицина, что составляет 60,0% от теоретического в расчете на N-аце- Tun-DL-fyeHunrnMuviH. Содержание основного вещества составляет99,1 %; + 154° (с 1,4; 1н. HCI).

Найдено, %: С 63.78;Н 6,25: N 9,41.

C9H9N02

Вычислено, %: С 63,56; Н 6,00; N 9,27.

Пример. Получение L-фенилала- нина.

Процесс проводят аналогично примеру 2, но L-фенилаланин получают на пилотной установке.

Первый цикл получения L-фенилала- нина.

В 25-литровый стеклянный аппарат марки Slmax, снабженный мешалкой, термометром и змеевиком для подогрева помещают 17 л дистиллированной воды и 1,425 кг (6,911 моль)М-ацетил-01 -фенилала- нина. Поднимают температуру до 40°С и при перемешивании порциями прибавляют 5н. водный раствор едкого натра до получения рН 7,8. Температуру в аппарате поддерживают с помощью ультрэтермостата. Затем добавляют двуххлористый шестивод- ный кобальт в количестве, необходимом для обеспечения концентрации 7,5 х моль, и 10,9 г ферментного препарата аминоаци- лазы, а также дистиллированной воды до 20 л. Температуру реакционной смеси поднимают до 50°С и при перемешивании осуществляют энантиоселективный гидролиз в течение 30 ч. рН реакционной среды в течение всего гидролиза поддерживают равной 7,8 добавлением 2н. водного раствора NaOH.

После 11 ч гидролиза добавляют еще 3,7 г ферментного препарата и продолжают гидролиз 17ч.

Через 28 ч гидролиза температуру реакционной массы поднимают до 60°С и при этой температуре выдерживают 2 ч. Конец реакции определяют методом, указанным в примере 1. После завершения энантиосе- лективного гидролиза рН реакционной смеси доводят до значения 5,0 уксусной кислотой поднимают температуру до 80°С и подвергают очистке активированным углем. Уголь отделяют на нутч-фильтре, объемом 25 л. Фильтрат концентрируют на роторном испарителе до появления кристаллов. Выпавшие кристаллы L-фенилаланина после стояния при 2°С в течение 4 ч отделяют на нугч-фильтре и промывают 80%-ным изо- пропиловым спиртом.

L-Фенилаланин высушивают в сушильном шкафу при 60-70°С.

ПолучаютЗбО г L-фенилаланина с содержанием основного вещества 99,4%; --34°(с-1;Н20).

Первый цикл рацемизации М-ацетил-D- фенилаланина.

В 5-литровый стеклянный аппарат марки Slmax, снабженный рубашкой, мешалкой, термометром и обратным холодильником, помещают маточный раствор, содержащий Ы-ацетил-О-фенилэланин, включают мешалку, добавляют 12,3 моль уксусного ангидрида и осуществляют рацемизацию М-ацетил-О-фенилаланина. М-Ацетил-DL- фенилаланин после рацемизации осаждают соляной кислотой при рН 1,7.

Получают 0,920 кг технического М-аце- тил-01 -фенилаланина с содержанием влаги не более 15%.

Второй цикл получения L-фенилаланина.

0,920 кг технического N-a4eTHfl-DL e- нилаланина помещают в 25-литровый аппарат, растворяют в 9,8 л дистиллированной воды и осуществляют энантиоселективный гидролиз с помощью 7,3 г ферментного препарата аминоацилазы: сначала прибавляют

5.5г, а затем, после 11 ч гидролиза, - еще 1,8 г ферментного препарата и продолжают гидролиз еще 19 ч.

Получают 209 г L-фенилаланина с содержанием основного вещества 99,1%; -35°( Н20).

Второй цикл рацемизации М-ацетил-О- фенилаланина.

М-Ацетил-О-фенилаланин в маточном растворе, оставшемся после второго цикла гидролиза, рацемизируюг с помощью

6.6моль уксусного ангидрида аналогично первому циклу рацемизации.

Получают 460 г технического М-ацетил- DL-фенилаланина с содержанием влаги не более 15%.

Третий цикл получения L-фенилаланина.

L-Фенилаланин получают, как описано в первом цикле с той разницей, что 460 г технического М-ацетил-DL-фенилаланина растворяют в 5 л дистиллированной воды, а энантиоселективный гидролиз осуществляют с помощью 3,7 г ферментного препарата аминоацилазы: сначала прибавляют 2,47 г, а затем, после 11ч гидролиза, - 1,23 г.

Получают 95 г L-фенилаланина с содержанием основного вещества 99,2%; -35°( Н20).

Третий цикл рацемизации М-ацетил-0- фенилаланина.

В четырехгорлую круглодонную колбу, емкостью 2 л, снабженную мешалкой, термометром, обратным холодильником и капельной воронкой, помещают маточный раствор после третьего цикла получения L- фенилаланина, включают мешалку и прибавляют 3,3 моль уксусного ангидрида. Рацемизацию М-эцетил-О-фенилаланина и выделение М-ацетил-ОЬ-фенилаланина осущесгвляют аналогично первому циклу рацемизации М-ацетил-О-фенилаланина.

Получают 230 г технического N-ацетил- DL-фенилаланина с содержанием влаги не более 15%.

Четвертый цикл получения L-фенилала- нина.

В 5-литровый стеклянный аппарат марки Slmax, снабженный рубашкой, обратным холодильником и мешалкой, помещают 230 г технического М-ацетил-ОЬ-фенилала- нина, растворяют в 3 л дистиллированной воды и подвергают энантиоселективному гидролизу с помощью 1,85 г ферментного препарата аминоацилазы: сначала прибавляют 1,2 г препарата, а затем, после 11ч гидролиза, - 0,65 г препарата.

Получают 53 г L-фенилаланина с содержанием основного вещества 99,1%; -35°(с 1; Н20).

Четвертый цикл рацемизации М-ацетйл- D-фенилаланина,

Маточный раствор, содержащий М-ацё- тил-О-фенилаланин, образующийся на четвертом цикле получения L-фенилаланина, объединяют с остатками, полученными после удаления 80%-ного изопропилового спирта на стадиях 1-4, и подвергают рацемизации с помощью 4,0 моль уксусного ангидрида аналогично 1 и 3 циклам рацемизации.

Получают 170 г технического N-ацетил- DL-фенилаланина с содержанием влаги не более 15%.

Пятый цикл получения L-фенилаланина.

170 г технического N-aцeтил-DL-фeни- лаланина подвергают энантиоселективному гидролизу с помощью 1,5 г ферментного препарата аминоацилазы: сначала прибавляют 1 г, а затем, после 11 ч гидролиза, - 0,5 г препарата.

Получают 39 г L-фенилаланина с содержанием основного вещества 99,2%; -35°( Н20).

Таким образом, после пяти циклов гидролиза Ы-ацетил-ОЬ-фенилаланина получают 746 г L-фенилаланина, что составляет 64,2% от теоретического в расчете наМ-аце- THn-DL eHnnaflaHHH. Содержание основного вещества 99,2%; aft0 -35° (с 1; ). Продукт хроматографически гомогенен.

Найдено, %: С 65,63; Н 6,54; N 8,52.

CgHnN02

Вычислено, %: С 65,44; Н 6,71; N 8,48.

Примере. Получение L-валина.

Процесс проводят аналогично примеру 1, но L-валин получают на пилотной установке и энантиоселективный гидролиз М-ацетил-DL- валина осуществляют нерастворимой, включенной в полиакриламидный гель, иммобилизованной аминоацилазой.

Первый цикл получения L-валина.

В 25-литровый стеклянный аппарат марки Slmax, снабженный змеевиком, мешалкой и термометром, помещают 15 л дистиллированной воды и 0,32 кг (2 моль) N-aue-rwn-DL-BanwHa. pH содержимого аппарата доводят до 7,2 едким натром, добавляют двуххлористый шести водный кобальт в количестве, необходимом для получения концентрации 7,5 х моль последнего, добавляют 154 г иммобилизованного фермента с аминоацилазной активностью 0,19 мкм/ч на 1 мг сухого препарата и доводят объем смеси до 20 л дистиллированной водой.

При перемешивании и температуре 50°С осуществляют энантиоселективный гидролиз в течение 24 ч. Катализатор отделяют фильтрованием и используют в последующих гидролизах. L-Валин выделяют и сушат по примеру 1.

Получают 72,0 г L-валина с содержанием основного вещества 99.3%; +27° (с 1;5н. HCI).

Первый цикл рацемизации М-эцешл-О- валина.

Маточный раствор, содержащий М-аце- тил-0-валин, помещают в 5-литровый стеклянный аппарат марки Slmax, снабженный мешалкой, рубашкой, термометром, капельной воронкой и обратным холодильником, и подвергают рацемизации с помощью 7,35 моль уксусного ангидрида. Выделение М-ацетил-С -валина осуществляют по примеру 1.

Получают 172,5 г технического N-аце- THfl-DL-eaflHHa с содержанием влаги не более 20%.

Второй цикл получения L-валина.

172,5 г технического М-ацетил-01-вали- на растворяют в 10 л дистиллированной воды и подвергают энантиоселективному гидролизу аналогично первому циклу получения L-валина.

Получают 40,5 г L-взлина с содержанием основного вещества 99,1 %; а&° +26° (с 1; 5н, HCIJ.

Второй цикл рацемизации N-ацетил-О- валина.

N-Ацетил-О-валин, образованный после второго цикла получения L-валина, подвергают рацемизации с помощью 3,15 моль уксусного ангидрида, как описано в первом цикле рацемизации примеров 1 и 8. 67,5 г технического М-ацег лп-0(.-вапина растворяют в 5,0 л дистиллированной воды и подвергают энантиоселективному гидролизу,

аналогично первому циклу получения L-ва- лина.

Получают 18,5 г L-валина с содержанием основного вещества 99,2%; а Ь° +27° (с 1;5н. HCI).

Третий цикл рацемизации М-ацетил-D- валина,

N-Ацетил О-валин, образованный после третьего цикла получения L-валина, помещают в четырехгорлую круглодонную колбу емкостью 2 л, снабженную мешалкой, термометром, обратным холодильником и капельной воронкой, и подвергают рацемизации с помощью 1,38 моль уксусного ангидрида по примеру 1.

Получают 37,5 г технического М-эцетил- DL-валина с содержанием влаги не более 20%.

Четвертый цикл получения L-вглина.

37,5 г технического М-ацетил-01 -валима помещают в стеклянный аппарат марки Slmax емкостью 5 л, снабженный рубашкой, обратным холодильником и мешалкой, добавляют 3 л дистиллированной воды и осуществляют энантиоселективный гидролиз аналогично первому получения L- валина.

Получают 8,5 г L-валина с содержанием

основного вещества 99,0%: +25° (с-1:5н. HCI).

Четвертый цикл рацемизации М-ацетил- D-валина.

Маточный раствор, содержащий М-аце- тил-0-валин, образованный на четвертом цикле получения L-валина, объединяют с остатками, полученными после удаления 80%- ного изопропилового спирта на стадиях 1-4 и подвергают рацемизации с помощью 0,48 моль уксусного ангидрида.

Получают 20,5 г технического М-ацетил- DL-валина с содержанием влаги не более 20%.

Пятый цикл гидролиза L-валина.

20,5 г технического N-aцeтил-DL-вaлинa растворяют в 2,5 л дистиллированной воды и осуществляют энантиоселективный гидролиз аналогично мерному циклу получения L-валина.

Получают 5,0 г L-валина с содержанием

основного вещестпа 99,1%; «1Ъ 26° (с- 1;5н. НС).

Таким образом, после пяти циклов гидролиза М-ацетил-О1 -вдлина получают 144.5 г L-валина, что составляет 61,8% от теоретического в расчете на М-ацетил-01.-валин. Содержание основного вещества 99.2%;

«)0-+270(с 1:5н. HCI). Продукт хрома- тографически гомогенен.

Найдено, %: С 51,32; Н 9,60; N 12,03.

С5НцМ02

Вычислено, %: С 51,26; Н 9,47; N 11,96.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет увеличить выход L-аминокислот в 1,4-2,6 раза с содержанием основного вещества 99,1-99,3 против 98-98,5% в известном способе. Упрощение процесса заключается в проведении его в воде, повторном использовании для получения целевых продуктов остающихся отходов N-ацетил-О-аминокис- лот и иммобилизованного ферментного препарата.

Формула изобретения

1.Способ получения оптически актив ных L-аминокислот из N-aцe ил-DL-aминo- кислот путем гидролиза с помощью ферментного препарата амилоризин. содержащего аминоацилазу, в присутствии ионов кобальта с концентрацией 7,5 моль с выделением L-аминокислоты, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и качества целевого продукта и упрощения процесса, в качестве фермента используют препарат с активностью 330- 400 ед./г в растворенном или иммобилизованном на полиакриламидном геле, причем фермент вводят в процесс дробно, и N-аце- тил-0-аминокислоту, полученную после выделения L-аминокислоты, подвергают рацемизации в маточном растворе с помощью уксусного ангидрида, а затем проводят повторный гидролиз.

2.Способ поп. 1,отличающийся тем, что гидролиз N eTHfl-DL-aMHHOKHCflOT осуществляют при 50-60°С.

Изобретение относится к аминокислотам, в частности к получению оптически активных L-аминокислот, используемых в химии, медицине и пищевой промышленности. Цель - повышение выхода и качества целевого продукта при упрощении процесса. Его ведут гидролизом Ы-ацетил-О - аминокислот с помощью ферментного препарата амилоризина, содержащего аминоацилазу (активность 390 ед./г в иммобилизованном на полиакриламидном геле или в растворенном виде), в присутствии ионов кобальта концентрацией 7,5 10 М (лучше при ). Фермент вводят в процесс дробно, выделяют L-аминокислоту, а оставшуюся N-ацетил-О-аминокислоту подвергают рацемизации в маточном растворе с помощью указанного ангидрида, а затем проводят повторный гидролиз, Эти условия позволяют увеличить выход целевого продукта в 1,4-2,6 раза с содержанием основного вещества 99,1-99,3 против 98-98,5% в известном способе. Упрощение процесса достигается за счет проведения его в воде и повторного использования остающихся отходов М-ацетил-О-аминокислот и иммобилизованного ферментного препарата. 1 з.п.ф-лы. СО