Способ получения @ - @ -аминокислот Советский патент 1982 года по МПК C07C101/00 C12D13/06 

Изобретение относится к усовер шенствованному способу получения 0-с(гаминокислот-общей формулы (I)

R-CH-COOH

Шз

где R-2-метилмеркаптоэтильная, фенильная. бензильная, 2-м(гтилпропильная, пропильная, индолилметильная, 4-оксифенильная, З-оксифенильная или 3-цианопропильная группы, использующихся в фармацевтической промышлёН- . кости. . .

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения природных 0-с аминокислот микробиологическим гидролизом соответствующих гидантоинов с помощью микроорганизмов, например, . Pseudomonas solanacearum АЗ 11149, Pseudomonas caryophHli : A3 11150. Выходрл целевых продуктов составляют в среднем 20% 1.

Недостатком известного способа является низкий выход целевых продуктов .

Целью изобретения является повьаиение выхода целевых продуктов.

Указанная цель достигается тем, ; что согласно способу получения D-oi: -аминокислот вьх1}еуказанной общей фор;мулы (1), где R - имеет вышеуказанное значение, микробиологическим гидролизом гидантоина общей формулы (II)

,,c-jra it- «

10

N-с

Н 7 II но

где R - вышеуказанные значения с помощью микроорганизма Pseudomonas

15 Sp., НМ-40 (CBS 259.79) и образовавшуюся О-о/.-аминокислоту выделяют хроматографией на ионообменной смоле Dowex - 50 или осаждением в изоэлектрической точке.

20

Выходы целевых продуктов составляют 80-92,5%.

Отличием предлагаемого способа является то, что гидролиз осуществляют микроорганизмом Pseudomonas sp.

25 (CBS 259.79).

Положительным эффектом предлагаемого способа является значительное увеличение выхода целевых продуктов р 20% до 80-92,5%.

Пример 1, а. Получение ферментной композиции.

Готовят культуральную среду следующего состава, г/л:

Глюкоза20

Однозамещенный фосфат калия 3 Дв у 3 амеще н ный фосфат калия 7 Сульфат магния 0,7 Сульфат марганца 0,02. Сульфат железа (II) О, 02 Хлорид натрия 1 Гидантоин D, L -метионина3

Среду разливают в склянки емкостью |250 см израсчета 50 см на склянку стерилизуют в течение 15 температуре 120с, После посева штамма Pseudomonas .:Sp. на избирательной среде с агаром С1 лянки перемеш.ивают (.250 od/мин) в течение 48 ч при температуре .

Продуктивное выращивание осуществляют в ферментере емкостью 2 л, содержащем 1-л вышеуказанной культуральной среды и 1 см противопенного агента. Засевают склянки штаммом, приготовленным как указано выше. Культуру выращивают при температуре 30°С в течение 48 ч при переметиваНИИ турбинной мешалкой (скорость вращения 500 об/мин) и при аэрации стерильным воздухом с расходом 1 л/мин,

К концу роста клеточную массу отделяют центрифугированием и суспендйруют в 50 см дистиллированной воды. Данная суспензия содержит 7,б сухого экстракта на 100 см.

в. Гидролиз D,L-фенилаланингвдантоина. а

К 200 СМ дистиллированной воды добавляют 5 г D,L-фенилаланингидантоина. Нагревают с целью частичного растворения гида нтоина, затем среду охлаждают до 37°С. Доводят рН до 7,8 путем добавления 1н. раствора едкого натра. После этого добавляют 25 см клеточной суспензии, полученной раньше. Доводят объем реакционной смеси до 250 см, а рН доводят до 7,8.

Реакционную смесь помещают в атмосферу азота, поддерживают температуру 37°С, поддерживают рН 7,8 путем постепенного добавления 1н. раствора едкого натра.

После умеренного перемешивания в течение 24 ч весь гидантоин переходит в раствор.

Реакционную смесь осветляют центрифугированием, затем пропускают через ионообменную смолу (смола Dowex 50, форма Н),.элюируя 2н. раствором аммиака.. Щелочные фракции упаривают досуха. Получают 3,98 г D-фенилалани

на (выход 92,5%) со следующими

свойствами. 2О

Id3-i3 29,2 ±2° (с 1, вода)

(%) 8,63 (по теории 8,48)

N

Потенциометричёское титрование: 93,3%.

Оптическая чистота полученного 0-фенилаланина превышает 93%.

Пример 2. К 150 см дистиллированной воды добавляют 4 г D,L-метионингидантоина и 8 см клеточной суспензии, содержащей 0,6 г сухого экстракта (полученного в условиях, описанных в примере 1).

Доводят рН до 7,8 путем добавления 1н. раствора едкого натра. Объем реакционной смеси доводят до 200 см путемдобавления дистиллированной воды. Реакцию проводят в течение 24 ч при температуре 37°С, поддерживая рН 7,8 путем постепенного добавления 1н. раствора едкого натра..

Содержание D-метионина в реакционной смеси определяют по методу Штейн и Мура: его концентрация составляет 17 г/л, что соответствует 100% превращения в расчете на взятый D,1-метионингидантоин.

Реакционную смесь осветляют центрифугированиел затем пропускают через ионообменную смолу (смола Dowex 50, форма Н) ; Получают 2,7 г D-метионина (выход 80%) со следующими свойствами:

2, -19,3° (с 1; 5н. хлористоводородная кислота) N 1%) 9,36-9,42 (теоретическое: 9,39)

Оптическая чистота полученного D-метионина близка к 90%.

Пример 3. а. Получение ферментной композиции.

Готовят культуральную среду сле дующего состава,г/л:

Глюкоза .20

Дрожжевой экстракт 10 Бактопептон10

Среду разливают в склянки емкостью 250 см из расчета 50-см на склянку и стерилизуют в течение 15 мин при температуре 120 С. После посева щтамма Pseudomoinas Sp. НМ-40 склянки перемешивают (25Ооб/мин) в течение 24 ч при температуре .

Содержимое одной склянки используют для обсеменения фер-ментера емкостью 2 л, содержащего 1 л вышеуказанной среды. Культуру выращивают в течение 24 ч при температуре при перемешивании турбинной мешалкой со скоростью вращения 500 об/мин и аэрацией стерильным воздухом с расходом 1 л/мин.

К концу выращивания микробную массу отделяют центрифугированием и суспендируют в 100 см дистиллированно воды, эта суспензия содержит 8,9 г сухого клеточного экстракта. в. Ферментный гидролиз метионингидантоина. Растворяют 5 г D-r -метионингидан тонна в 200 см дистиллированной во ды. Доводят рН до 7,5 путем добавле ния 0,1 н. раствора „едкого натра, з тем добавляют 20 см полученной ран клеточной суспензии, объем доводят до 250 см, реакционную смесь помещ ют в атмосферу азота, температура р акционной смеси 37°С. После проведения процесса в тече ние 5 ч содержание метионина в сред определяют хроматографическим методом по методике Штейна и Мура. Опре деляют гидантионазную активность клеточной суспензии (количество мол метионина, продуцирова1«ного на 1 мг сухого клеточного экстракта в 1 ч ферментативной реакции) она составл ет 4 , 5 ... 1 После проведения процесса в тече;ние 22 ч реакционную смесь осветляют центрифугированием. Образовавшийся метионин отделяют пропусканиемчерез ионообменную смолу (Dowex 50, форма н), элюируя 2н. раствором аммиака. Элюат выпаривают досуха и сушат, получают 3,9 г D-метионина (выход 91%) со следующими свойствами: N (%) 9,4 (теоретическое содержание 9,33%J 23°(С 1, 5н. хлористоводородная кислота). Потенциометрическое титрование 98%. Пример 4. Ферментативный гидролиз L-оксйфенилглицингидантоина Готовят. 100 см,суспензии , содержащей 8,9 г сухого клеточного экстракта в условиях, описанных в примере 3 а. Растворяют 5 г 4-оксифенилглицинпу рантоина в 250 см дистиллированной воды. Доводят рН до 7,5 путем добавления 0,1 н.раствора едкого натра и добавляют 20 см клеточной суспензии. Объем доводят до 250 см реакционную смесь помещают в атмосферу азота,температура реакционной смеси 31°С. После проведения процесса в течение 5 ч определяют содержание 4-оксифенилглицина. Гидантоиназная активность составляет 1, 8 М аминокислоты на 1 мг сухого клеточного экстракта в 1 ч протекания ферментативной реакции. После проведения процесса в течение 22 ч 4-оксифенилглицин отделяют пропусканием через ионообменную смолу (Dowex 50, форма Н) . Получают 3,78 г D-(4-оксифенил)-глицина (выход 87%). оказавшегося однородным при хроматографии, со следующими свойствами: N (%) 7,6 (теоретическое содержание 8,4) Ы3%° -135 (С 1, 5н. хлористоводородная кислота) Потенциометрическое титрование 110%. Пример 5. Выращивают штамм Pseudomonas Sp, НМ-40 в следующих условиях: Состав культуральной среды, г/л: Глюкоза20 Двузамещенный фосфат калия7 Однозамещенный фосфат калия3 Сульфат магния 0,7 Сульфат марганца 0,02 Сульфат железа 0,02 Хлорид натрия. 1 D-L-метионингидантоин3Дрожжевой экстракт 2 Предварительное выращивание. Первое предварительное выращивание выполнено в склянке емкостью 250 см, содержащей 50 см среды, в течение 24 ч. Второе предварительное выращивание посева, сделанного из предыдущей склянки,. осуществлено . тоже в течение 24 ч в ферментере емкостью 2.л, содержащем 1 л культуральной среды. Продуцирующая культура. Содержимое двухлитрового ферментера используют для обсеменения ферментера емкостью 7,5 л, содержащего 5 л среды. Культуру выращивают в течение 24 ч при температуре при аэрации .стерильным воздухом с расходом 5 л/мин и перемешивании турбинной мешалкой со скоростью 500 об/мин. Полученная в таких условиях биомасса составляет 3,8 г сухого экстракта на 1 л культуральной среды. Ферментативная реакция. По окончании выращивания микробную массу отделяют от среды центрифугированием и суспендируют в 250 см дистиллированной воды. Суспендируют 10 г D,L-фенилглицинг гидантоина в 400 см дистиллированной воды и доводят рН до 7,5 путем добавления 0,1 н. раствора едкого натра. Добавляют 50 см вышеописанной клеточной суспензии и реакционный объем доводят до 500 см добавлением воды. Помещают в атмосферу азота при температуре , поддерживая рН 7,5 в течение 17 «. После протекания процесса в течение 17 ч реакционную смесь осветляют центрифугированием, упаривают до 1/5 первоначального объема и подкисляют до/рН 1 путем добавления кон центрированной соляной кислоты. Образующийся осадок отделяют фильтрованием и сушат. Хроматографи ческий анализ показывает, что он предс-тавляет собой фенилглицингидан тоиновую кислоту со следующими свойствами: N {%) 13,9% (теоретическое содержание 14,4%} ГоЗ 15° -1370 (с 1; 1% амВыход полученной Оггидантоиновой кислоты 6,3% по отношению к взятому гидантоину. Маточный раствор снова упаривают и доводят.- до рН 5 путем добавлени едкого натра, выпавший в осадок D-фенилглицин отделяют фильтрованием промывают водой и этиловым спиртом, сушат. Получают 7,6 г -О-фенилглицин (выход 88%) со следующими свойствами: , .N (%) 9,2 (теоретическое содержание 9,3) Hd - -148 (С 1; 5н. хлористоводородная кислота) Пример 6. Выращивают культуру Pseudomonas Sp., НМ-40 в условиях примера 5. После центрифугирования микробную массу суспендируют в О,1 М фосфатом буферном растворе при рН 7,8, эту суспензий используют в качестве катализатора гидролиза различных гидантоинов, условия реакции следующие:начальная концентрация гидантоина 20 г/л в 0,1 М фосфатном буферном растворе при рН 7,8; примененная биомасса составляет 6,5 г (в расчете на сухой экстракт) на 1 л реакционной смеси температура реакции продолжительность реакции 5 ч. Затем определяют содержание в реакционной смеси образукнцейся аминокислоты и по ней вычисляют ферментативную активность клеточного экстракта . Вычисленная таким образом активность представлена в таблице в микромолях аминокислоты, образовавшейся на 1 мг сухого ферментного экстракта в 1 ч реакционного времени, i Результаты представлены в табли це.

01-метионингид9нтоин

DL- 2-фенил -аланингидантоин

DL-лейцингидантоин

DL-валингидантоин

DL-триптофангидантоин

DL- 14-оксифенил)-глицингидантоинПример 7. По способу, описанному в примере 6, полу ьают клеточную суспензию Pseudomonas НМ-40 в. 60 буферном фосфатном растворе. Эта суспензия содержит 6,5 г сухого экстракта в 100 см , п-еред применением клетки измельчены ультразвуком при. условиях: 65

2,4

2,0 1,6

1,0

D-валин

О,. 6

D-фенилглицин

D- (4-оксифенил)-глицинО,6

D- 1-амино-(4-циан пропионовая кислота3,5

D- (3-оксифенил)-глицйн0,7 / до Аппарат PONS, оборудованный зонТС4С . Частота ультразвука , кГц Обработанный объем, см Продолжительность измельчения, мин Обработанная таким образом суспензия применена для катализа процесса гидролиза гидантоинов метиони на, фенилаланина и фенилглицина в у ловиях эксперимента у описанных в пр мере 6. При этом измеренная активность была следующей, мкмоль/мг/ч: ОЬ-метионингидантоин1/7D1-(2-фенил)-аланин- ; гйдантоин1,0 DL-фенилглицин- . гидантоин0,8 П р и м е р 8. Клеточную суспен зию Pseudomonas.SP НМ-40 в воде, по лученную как описано в примере 5, и содержащую, 7,3 г сухого экстракта в 100 см , лиофилизируют перед прим нением в следующих условиях. 120 см суспензии разливают в 4 колбы емкостью 500 см , замораживают и выдерживают при пониженном дав лений (О, 5 рт.ст. ) в течение 16 ч Получают 8,8 г порошка лиофилизрванного фермента, который при меняют вусловиях, описанных в примере 6. Определена следующая активность, мкмоль/мг/ч: pL-метионингидантоин2,4 DL-фёнилглицингидантоин0,4 DL- 12-фенил)-аланингидантоин 1,5 Формула изобретения Способ получения Т)-li-аминокислот общей формулы R-OH-COQH где R-2-метилмеркаптоэтильная,фенильная, бензильная, 2-метилпропильная, пропильная, индолилметильная, 4-оксифенильная, 3-оксифенильная или 3-цианопропильная группы,f микробиологическим гидролизом гидантоина общей формулы ,C-NH -s имеет указанные значения, с последующим вьщелейием целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевых продуктов, гидролиз осуществляют микроорганизмом Pseudomonas Sp., НМ-40 {CBS 259,79), Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1, Патент Франции № 7817199, кл. С 12 D 13/06 опублик. 05.01.79 (прототип).