Способ получения оптически активных аминокислот из рацемических смесей N-ацетил- @ -аминокислот Советский патент 1982 года по МПК C07K1/14 C07C229/04 

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения оптически активных аминокислот путем ферментативного гидролиза N-ацетилпройзводных рацематов аминокислот и может быть использовано в микробиологической, химической и медицинской промыишенности.

Известен способ получения оптически активных аминокислот с использованием в качестве источника фермента для гидролиза рацематов N-ацетиламинокислот ацетонового порошка, приготовленного из коркового слоя свиных почек, или экстрактов свиных почек {.

Процесс ведут при рН 7 и температуре 37°С.

Применение ферментных препаратов из почек для гидролиза рацематов ацетиламинокислот позволяет проводить асимметрический гидролиз многих Ы-ацетил-О, L-аминокислот с хорошим выходом. Недостатками этого способа являются необходимость использования для получения Фермента дорогостоящего пищевого сырья и ограниченность использования способа связанная с тем, препараты фермента из свиных почек вообще не- гидролизуют

ацетилпроивводных таких аминокислот, как триптофан и фенилаланин.

Целью изобретения является удешевление и упрсяцение процесса.

Цель достигается тем, что рацемическую смесь М-ацвтил-с1-аминокислот гидролиэуют с помощью препарата амилоризина и процесс ведут в присутствии ионов кобальта в концентра10ции S-IO M.

Отличительными признаками предложенного способа являются использование в качестве ферментного препарата амилорезина и проведение про15цесса в присутствии ионов кобальта в концентрации 5-10 М. . Препарат амилоризин П1ОХ перед использованием очищают осаждением из водного раствора этанолом при рН 7 и

20 конечной концентрации этанола 50%,пред пЬчтительно. применяя предварительное осаждение примесей из водного раствора фермента 20%-ньм этанолом.

Пример 1. Получение L-ме25тионина из К-ацетил-0,Ь-метионина.

В химический стакан помещают 38,25 г (0,2;моль) N-ацетил-0,Ь-метионина и 0,0196 г CoCPji6 .Смесь растворяют в 400 мл воды при 40-50°С

30 и фильтруют на воронке Вюхнера.Затем

рН прозрачного раствора доводят до 7,8 с помощью 5 н, раствора едкого натра. К реакционной смеси добавляют 0,3 г частично очищенного препарата амилоризина, растворенного в 150 мл дистиллированной воды.

Частичная очистка амилориэина П1ОХ производится следующим образом.

60 г амилоризина ПЮХ суспендируют в 2 л дистиллированной воды и зкстрагируют при 20° и рН 7 в течение 2 ч, затем раствор центрифугируют 1 ч при 3000 об/мин. К супериатанту при 2С и рН 7 добавляют этанол с таким расчетом, чтобы его конечная концентрация составила 50 об.%. Выпавший в осадок белок отделяют центрифугированием, растворяют в минмальном объеме дистиллированной воды и лиофилизуют.Получают 16,5-17,0г частично очищенного ферментного препарата,активность которого,опреде ленная по гидролизу Ы ацетил-6, Lметионина, составляет 85-87 ел/г. Более зффектг вная очистка может быть достигнута,если экстракт амилорчзина полученный, как описано вьвне, под,вергнуть предварительно 4у осажд©.нию этанолом при концентрации последнего 20%. Дальнейшее вьщеление препарата проводится так, как описано выше. Активность такого препарата 120-125 ед/г, соответственно его загрузка .в опытах по гидролизу ацетиламинокислот уменьшается.

Асимметрический гидролиз N-ацетил0,Ь-метионина ведут при 37-38°С в те ченйе 30-36 ч, поддерживая рН 7,88,0 2 н. раствором едкого натра.Конец гидролиза определяют с помощью нингидриновой реакции (по прекращению нарастания поглощения при 570нм)

По окончании гидролиза Ы-ацети-О, L-метионина рН реакционной смеси доводят до 5 ледяной уксусной кислотой для инактивации фермента.Раствор нагревают до 80°С, добавляют О,5 г активированного -угля и через 10-15 мин фильтруют на воронке Бюхнера.Фильтрат упаривают в вакууме, создаваемом с помощью водоструйного насоса, при 40-50°С до 90-100 мл (при зтом частично выпадают кристаллы Ь-метионина). К остатку добавляют 560-630 мл 96%-ного этанола и выдерживают при 4-5 ч. Выпавшие кристгшлы L-метионина отфильтрованают на воронке Бюхнера, проминают 30м этанола и высушивают при 5О-60 С 5-6 ч, т.пл. 282С (с разл.).

Выход метионина 10-11 г (67-74% от теории) в расчете на N-ацетилL-метионик. Содержание основного вещества не менее 98,5%.

Маточный раствор, содержащий Nацетил-О-метионии следовые количества L-метионина, уксусную кислоту, этанол, катионы Со и Na упаривают в вакууме и хранят для дальнейшего использования.

Пример 2. Получение L-аланина из ацетил-D, L-аланина.

В химический стакан помещают 26, (0,2 моль) N-aцeтил-D,L-aL- анилина и 19,6 мг Сосе НаО. смесь растворяют в 400 мл дистиллированной воды при 40-50с и фильтруют на воронке Бюхнера, рН раствора доводят до 7,.2 5н. раствором едкого натра.О,Зг очищенного фе1миентного препарата, полученного из амилоризи«а ПЮХ,как описано в примере 1, растворяют в 150 мл дистиллированной воды,фильтрют и добавляют к реакционной смеси. Асимметрический гидролиз N-ацетилD,L-aнaлинa проводят при в течение 30-36 ч, поддерживая рН 7,2 ,2 н. раствором едкого натра. Выделение L-аланина проводят аналогично тому, как описано в примере 1. Выход Ъ-аланина 5,3-5,0, что составляет 60-65% от теоретического в расчете на N-aцeтил-L-aлaнин.Содержани основного вещества не менее 98,5%; т.пл. 297С (с разл.).

Пример 3. Получение L-валина из N-aцeтил-D,L-вaлинa.

В стакан помещают 15,91г(0,1 мол К-ацетил-О, L-валина, 19,6 мг СоС

6 %О. Смесь растворяют в 400 мл дистиллированной воды при 40-50 С, горячий раствор фильтруют на воронке Бюхнера, доводят рН до 7,0 5 н, раствором едкого натра. 0,15 г очищенного фе ялентного препарата, полученного из амилоризийа ПЮХ, как указано впримере-1, растворяют в 150 мл дистиллированной воды,раствор фильтруют и добавляют к реакционной смеси. Асимметрический гидролиз N-aцeтил-D,L-валина ведут при Э7-38°С в течение 30 ч при ностояннам поддерживании рН раствора 7,0 2н. раствором едкого-натра.

Вьшеление L-валина проводят аналогично тому, как сэписано в примере 1. Выход Ь-валина 5 г (85% от теори Содержание основного вещестЬа не менее 98,5%; т.пл.315С (с разл.).

Пример 4.Получение L-фенилаланина из N-aцeтил-D,Lтфeнилaлaнина.

В химический стакан панещакт 20,72 г {0,1 моль) N-aцeтил-D,L-фeнилаланииа, 19,6 мл СоСв б . Смесь растворяют в 400 мл дистиллированной воды при 40-50 С и фильтруют на вороике Бюхнера. Затем рН раствора доводят до 7,0 5н. раствором едкого натра. 0,15 г очищенного ферментного препарата, йолученного из амилоризина ПЮХ „как описано в примере 1, растворяют в 150 мл Ъоды, фильтруют и добавляют к реакционной смеси. Асимметрический гидролиз N-aцeтил-D,L-фeнилaлaнинa провоS9дят при 37-40°С в течение 30 ч, поддерживая рН 7,0. Выделение Lфенилашанина проводят аналогично. тому, как описано в примере 1. Выход его 6,05 г (73% от теории).Содержание основного вещества не меиее 98%; т.пл. 283С (с раэл.). Пример 5. Получение L-фет нилглицина из Ы-ацетил-О,1-фенилглицина. . б г Ы-ацетил-0,Ь-феиилглицина (0,03 моль) растворяют 150 мл Oj2 н.. раствора едкого натра добавляют О ,35 мл 50Мм раствора CoSO4 7 (конечная концентрация Со М) и рН смеси доводят до 8,5-9,0 2н. раство ром едкого натра. К реакционной смеси добавляют 1 г препарата амилоризина П10Х. Асимметрический гидроЛИЗ К-ацетил-0,Ь-фенилглицината ведут при 50°С в течение ч, поддерживая рН 8,5. Смесь отфильтровывают, подкисляют 2 н. соляной кислоты до рН 6. Образовавшийся осадок L3. 6 фенилглицина собирают на воронке Бюхнера и высушивают в шкафу при 60°С. Выход L-фенилглицина 1,05 г (50% от теории), Формула изобретения Способ получения оптически активных аминокислот из рацемических Ы-ацетил-о1-г№4инокислот путём-их гидролиза с помощью ферментного препарата,. содержащего ацилазу, о тличающийся тем, что, с целью удешевления и упрощения процесса, в качестве ферментного препарата для гидролиза используют амилоризин и процесс ведут в присутствии ионов кобальта в концентрации l lO 5-10Tl. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. i.P. Greensteln, M.Winitz, Chemistry of the amino acids, т.з., с. 1831-1840, 1961 (прототип).