Способ выделения ферментных препаратов из технического ферментного препарата -амилоризин П10Х Советский патент 1986 года по МПК C12N9/00 

1 Изобретение относится к микробио логии, а именно касается способа по лучения ферментных препаратов ацилазы, амилаз ипротеаз из микроби ологического сырья - амилоризина П10Х. Цель изобретения - расширение во можного спектра получения ферментны препаратов, повышение их выхода и активности. Способ заключается в последовательном вьщелении из технического ферментного препарата амилоризина ПЮХ ферментных препаратов протеазы аминоацилазы и амилазы путем постепенного повышения концентрации этан ла или изопропилового спирта при фракционировании. Способ осуществляется следую;йчим образом, : Пример 1, В двадцатилитро: вьтй стеклянный аппарат, снабженный змеевиком для охл.аждения, рассолом, мешалкой, капельной воронкой.и термометром помещают 3,5 л дистиллированной воды, 120 г амилоризина П10Х суспендированного в 0,5 л дастиллирвванной воды. Экстракцию ферментов осуществляют при перемешивании при -22 С и рН 7,0 в течение двух часов .рН поддерживают добавлением 2 н. .раствора едкого натра). Затэм открывают рассол,, снижают температуру содержимого аппарата до -IC и тонкой струей при и рН 7,0 прибавляют заранее охлажденный (-8°С) этанол до 25%-ного содержания. Выпавший ос док, представляющий собой препарат протеаз, отделяют центрифугирование на центрифуге К-70 при 3000 об/мин и температуре (-1)°С в течение 30 мин, растворяют в минимальном: рбъеме воды и суыат лиофильно. Протеазная активность ферментног препарата равна 29 ед/г, выход препарата по активности составляет 47% Супернатант переносят в аппарат и при перемешивании, температуре рН 7,0 тонкой струей прибавля Ът охлажденный () этанол до 50%-ного содержания последнего, Выпавший осадок, представляющий собой ферментный препарат аминоацилазы, отделяют центрифугированием, сушат лиофильно, Аминоацилазная активность препар та равна 390 ед/г. Выход продукта п активности составляет 95%. 6 Супернатант после выделения ферментных препаратов протеазы и аминоацилазы переносят в аппарат и в вышеуказанных условиях прибавляют охлажденный этанол до 70%-ного содержания, Выпавший осадок амилолитического препарата отделяют центрифугированием и сушат лиофильно, Амилолитическая активность препарата равна 5300-ед/г. Выход препарата по активности составляет 96%. Супернатант, представляющий собой 70%-ный раствор этанола, содержащий низкомолекулярные белки, пептиды и аминокислоты подвергают перегонке в вакууме при 60°С, Этанол используют повторно для этой не цели, а водный раствор, содержащий вышеуказанные продукты3 концентрируют до получения удельного веса, равного 1,1. Получают 120 мл продукта с ,l, содержащего 36,5 г сухих веществ, из которых 50% составляют аминокисло ты, среди 1Л)торых имеются такие незаменимые аминокислоты, какими являются метионин,, валик, лейцин, триптофан, фенилаланин. Пример 2, Процесс проводят аналогично примеру 1,с той разницей, что в. качестве спирта используют изопропиловый спирт, а конечные концентрации сгшрта соответственно равlibi: 30% при выделении протеаз, 45%аминоацилазы и 75% - амилаз. Получают ферментньш препарат с протеолитической активностью 25 ед/г, выход по активности составляет 56%; BNMHOацилазы с активностью 293 ед/г выход по активности 92%; амилазы с активностью 6500 ед/г выход по активности 87%. Количество сухого аминокислотного препарата составляет 23 г. Пример 3. Процесс проводят аналогично примеру 1, с той разницей, что высушивание препаратов осуществляют этанолом. Для этого мокрые ферментные препараты из центрифужных стаканов переносят в гомогенизатор, добавляют охлажденный (-8°С) этанол из расчета 30 мл на 10 г препарата и гомогенизируют в течение 5 мин, фильтруют на jBOpOHKe Бюхнера и сушат на воздухе в течение 12 ч. Активности ферментных препаратов составляют 26 а 410:, 6000 ед/г а выход 52, 97, 94%. ных препаратов на опытных установках в производственных условиях. Экстрак цию проводят водопроводной водой, осаждение осуществляют непрерывно пр 7 С, препараты выделяют на сепараторе-кларификаторе при 4170 об/мин и после лиофильной сушки подвергают дроблению, В экстрактор емкостью 700 л, снаб женный механической мешалкой помещают 200 л водопроводной воды с температурой 25°С, Суспендируют 11 кг ами лбризина П10Х в 163 л воды и переносят в экстрактор. Соотношение ферментного препарата и воды составляет 1:33. Экстракцию.осуществляют при 25 С и рН 7,0 в течение двух часов (рН поддерживают прибавлением 2н, раствора едкого натра). Экстракт насосом перекачивают в напорный бак (№ 1), емкостью 1 м, снабженный змеевиком, линиями рассола и воздуха. Подают умеренный ток воздуха и при перемешивании охлаждают содержимое бака до 3°С, Из напорного бака (№ 1) экстракт поступает через ротаметр в смесительную колонну диаметром 70 мм, высотой 1000 мм. В эту же колонну из напорного бака (№ 2), емкостью 50 м, через холо.дильник и второй ротаметр поступает этиловый гидролизный спирт с темпера турой -10°С, В смесительной колонне экстракт непрерывно смешивается с этанолом, при этом часть ферментов, присутствующих в экстракте, выпадает в осадок. Процентное соотношение эта нола в водно-спиртовой смеси составляет 25-26%. Осаждение происходит при -10°С. Суспензия ферментов в вод но-спиртовой смеси из смесительной колонны непрерывно поступает на сепаратор-кларификатор, где при 4170 об//мин отделяется от водно-спиртовой сме си. Осадок, представляющий собой ферментный препарат с протеазной активностью, выгружают из сепаратора-кларификатора на раскладочный стол, затем на кюветы. Кюветы с препаратом устанавливают в камере морозильного стола и замораживают до . Замороженный препарат помещают на этажер-55 ку, которая устанавливается в котле сублимационной сушилки, и сушат в течении 14 ч до температуры продукта 20°С. из сублимационной сушилки подвергают дроблению на дробилке. Протеолитическая активность ферментного препарата равна 27 ед/г, вьпсод препарата по активности составляет 60%. Водно-спиртовой раствор зкотрак- та после выделения протеазы поступает в напорный бак (№ 3), емкостью 2,7 м , снабженный змеевиком, линиями рассола и воздуха, где при умеренном перемешивании воздухом охлаждается до 3°С, Из напорного бака (W 3) водноспиртовая смесь через ротаметр поступает в смесительную колонну, где непрерывно смешивается с охлажденным (-8С) этанолом. Содержание этанола в смеси составляет 51%. Осаждение происходит при -9°С, При этом часть ферментов, присутствующих в зодноспиртовом растворе, выпадает в осаДок. Выделение осадка, представляющего собой ферментный препарат амнноадилазу, его высушивание и дробление осуществляют как описано вьш1е. Аминоацилазная активность ферментного препарата равна 430 ед/г, выход по активности составляет 98%, Водно-спиртовой раствор после выделения ферментных препаратовпротеазы аминоацилазы поступает в напорный бак (№ 1), охлаждается до -5°С. Далее поступает в сме.сительную колонну, где смешивается с этанолом. Содержание этанопа в смеси составляет 71%, Осаждение происходит при -9°С, Суспензия ферментов в водно-спиртовой смеси поступает на сепаратор и сепарируется при 41 70 об/мин. Осадок, представляющий собой амиполитический ферментный препарат, выделяют, высушивают и дробят. Амилолитическая активность ферментного препарата амилоризина (амилаза) равна 4500 ед/г, выход по активности составляет 98%. Зависимость количества перешедшего в раствор белка от соотношения амилоризина П10Х и воды представлена табл I. Из табл. видно, что соотношение амилоризина ПЮХ и воды, равное 1 : :(32-33), является оптимальным и его выбор ограничен, с одной стороны, неполной экстракцией ферментов, т.е. неполным переходом белка в раствор при уменьшении количества воды (ког512

да соотношение равно 1:10), с другой стороны, тем, что увеличение количества воды (когда соотношение равно 1:40).не приводит к заметным изменениям, т.е. полная экстракция белки из водного раствора амилоризина П10Х происходит при заявленном соотношении.

Из табл. 2 видно, что изменение концентрации этанола, как в сторону уменьшения нижнего предела (25%), так и в сторону увеличения верхнего предела (50%), приводит к снижению выхода ферментного препарата. в табл. 2 дана зависимость выхода

амииоацилазы от изменения концентрации этанола.

Таблица 1

Продолжение табл. I

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ИЗ ТЕХНИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА АМИЛОРИЗИН ПЮХ, предусматривакяций приготовление водного раствора исходного ферментного препарата, экстракцию и спиртовое осаждение целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью расширения возможного спектра получения ферментных препаратов, повышения их выхода и активности, водный экстракт готовят при соотношешт ферментного препарата и воды, равном 1:32-33, а осаждение осуществляют последовательно спиртовым фракционированием, .причем конечные концентрации спирта при фракционировании соответственАо равны 25-30% для выделения протеазы, 4550% - аминоацилазы, 70-75% - амилазы, при этом полученные ферментные препараты подвергают сушке. 149 Од сд to Ф