Способ выделения ферментных препаратов аминоацилазы, амилазы и протеаз из ASpeRGILLUS oRYZae Советский патент 1991 года по МПК C12N9/00 

Изобретение относится к технической микробиологии, касается получения ферментных препаратов из Амилоризина ПХ и может быть использовано в медицинской, химической, пищевой промыш- ленностях, в сельском хозяйстве, в медицине.

Целью изобретения является упрощение процесса с одновременным повышением активностей ферментных препаратов .

Изобретение заключается в том, что в качестве исходного сырья используют Амилоризин ИХ или поверхностную культуру его продуцента, а фракционирование водных экстрактов осуществляют спиртами или сульфатом аммония. Интервалы процентного содержания спиртов, при которых выпадают в осадок ферментные препараты: 35-40% для выделения протеазы, 45-50% для выделет ния аминоацилаэы и 72-75% для выделе10

ния амилазы. Для осаждения этих фер- ментных препаратов сульфатом аммония требуются соответственно 50%, 60% и 80% насыщения.

Пример 1. Ферментные препараты выделяют из высушенной культураль- ной массы A.oryzae, наделенной следующими активностями, ед./г: амилоли- тическая 160; протеолитическая 2,3; аминоацилазная 40 ед/г. Этот препарат выпускается под названием Амилори- зин ИХ.

В литровую трехгорлую круглодонную колбу, снабженную мешалкой, термомет- J5 ром и капельной воронкой, помещают 30 г Амилориэина ПХ, добавляют 200 мл дистиллированной воды и при 25 С, рН 7,0 и перемешивании осуществляют экстракцию в течение 2 ч. Значение рН 20 поддерживают добавлением 2 н, водного раствора гидроокиси натрия. Затем фильтруют на воронке Бюхнера. Осадок выбрасывают, а фильтрат, содержащий ферменты, центрифугируют на центрифу- 25 ге при 2°С и 4000 об/мин в течение 20 мин.

Супернатант переносят в колбу, охлаждают до 0-1°С и при перемешива10

J5 2025

4335

вакууме при 50-60°С досуха. Этанол используют повторно для той же цели. Осадок, содержащий 53% аминокислот, в том числе незаменимые аминокислоты, валин, триптофан, лейцин, фенилала- нин, используют для получения балансированных кормов.

П р и м е р 2. Процесс проводят аналогично примеру 1 с той разницей, что в качестве осадителя используют изопропиловый спирт, конечные концентрации которого соответственно равны: 35% при выделении протеазы, 45% аминоацилазы и /5% - амилазы.

Активности ферментных препаратов протеазы, аминоацилазы н амилазы составляют 20, 220, 1650 ед/r, а выход 26, 53 и 59% соответственно,

П р и м е р 3. Процесс проводят аналогично примеру 1 с той разницей, что в качестве осадителей ферментных препаратов используют сульфат аммония. Препараты перед лиофильной сушкой подвергают диализу против холодной дистиллированной воды.

В 20-литровый стеклянный аппарат марки Simax, снабженный линией для охлаждения рассолом, мешалкой и тер

Изобретение относится к технической микробиологии, касается получения ферментных препаратов из амило- ризина ПХ и может быть использовано в медицинской, химической, пищевой отраслях промышленности, сельском хозяйстве. Целью изобретения является упрощение процесса с одновременным повышением активностей ферментных препаратов . В качестве исходного сырья испопьэуют Амилоризин ПХ или поверхностную культуру его продуцента, а фракционирование водных экстрактов осуществляют спиртами или сульфатом аммония. Интервалы процентного содержания спиртов, при которых выпадают в осадок ферментные препараты: 35- 45% для выделения протеазы, 45-50% для выделения аминоацилазы и 72-75% для выделения амилазы. Для осаждения этих ферментных препаратов сульфатом аммония требуется соответственно 50, 60 и 80% насыщения. (Л аъ ел -U оо со ел

нии добавляют этанол до получения 40% -$0 мометром, помещают 10 л водного экстсодержания последнего. Выпавший осадок, представляющий собой препарат протеазы, отделяют центрифугированием в вышеуказанных условиях, растворяют

ракта, полученного из 1,5 кг Амило- ризина ПХ. Пускают в ход мешалку и при рН 7,0 и температуре 2°С небольшими порциями добавляют сульфат аммов минимальном объеме воды и сугаат лио-,, ния до получения 50% насыщения послед- фильно. Выход препарата по активности 33%, активность 26 ед/г.

Супернатант переносят в колбу и в описанных условиях добавляют этанол до получения 50% содержания спирта. 4Q

Выпавший осадок, представляющий собой препарат аминоацилазы, отделяют и сушат, как описано выше. Выход продукта по активности составляет 78%. Аминоацилазная активность равна д5 720 ед/г.

Супернатант после выделения ферментных препаратов протеаэы и амино- ацилаэы переносят в колбу и в описанных условиях добавляют этанол до 75% 5Q содержания последнего. Выпавший осадок -амилолитический препарат отделяют и сушат, как описано выше. Выход препарата по активности 76%. Амило- литическая активность равна 4000 ед/г.

Супернатант, представляющий собой 75%-ный раствор этанола, содержащий низкомолекулярные белки, пептиды и аминокислоты, подвергают перегонке в

Ь5

него и оставляют при 2-5°С в течение 16 ч. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин, растворяют в минимальном объеме воды и переносят в целлофановую пленку (сосисочную) и осуществляют диализ против холодной воды до полного удаления сульфат-иона. Отсутствие сульфат-иона проверяют 20% хлористого бария. Содержимое диализного мешка сушат лио- фильно.

Протеолитическая активность ферментного препарата 29,0 ед/г. Выход по активности 23,0%.

Супернатант переносят в аппарат и в описанных условиях добавляют сульфат аммония до получения 60% насыщения последнего.

Отключают мешалку и оставляют при 2-5°С в течение 16 ч.

Выпавший осадок, представляющий собой ферментный препарат аминоацила зы, подвергают диализу и сушат лист фильно, как описано выше.

мометром, помещают 10 л водного экстракта, полученного из 1,5 кг Амило- ризина ПХ. Пускают в ход мешалку и при рН 7,0 и температуре 2°С небольшими порциями добавляют сульфат аммония до получения 50% насыщения послед-

него и оставляют при 2-5°С в течение 16 ч. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин, растворяют в минимальном объеме воды и переносят в целлофановую пленку (сосисочную) и осуществляют диализ против холодной воды до полного удаления сульфат-иона. Отсутствие сульфат-иона проверяют 20% хлористого бария. Содержимое диализного мешка сушат лио- фильно.

Протеолитическая активность ферментного препарата 29,0 ед/г. Выход по активности 23,0%.

Супернатант переносят в аппарат и в описанных условиях добавляют сульфат аммония до получения 60% насыщения последнего.

Отключают мешалку и оставляют при 2-5°С в течение 16 ч.

Выпавший осадок, представляющий собой ферментный препарат аминоацила зы, подвергают диализу и сушат лист фильно, как описано выше.

516

Аминоацилаэная активность препарата 850 ед/г. Выход продукта по активности 85%.; Супернатант после выделения амино- ацилазы переносят в аппарат и при описанных условиях продолжают добавление до получения 80% насыщения сульфатом аммония. Отключают мешалку и содержимое аппарата оставляют при 2-5°С в течение 16 ч.

Выпавший осадок, представляющий собой ферментный препарат амилазы, отделяют, подвергают диализу и лио- фильно сушат, как описано выше.

Амилолитическая активность препарата 12000 ед/г. Выход продукта по активности 21%.

П р и м е р А. Процесс проводят аналогично примеру 3 с той разницей, что высушивание ферментных препаратов осуществляют этанолом непосредственно после осаждения, минуя стадию диализа

Для этого мокрые ферментные препараты из центрифужных стаканов переносят в гомогенизатор, добавляют охлажденный до минус 8-10°С этанол из расчета 25-30 мл на Ю г препарата и гомогенизируют в течение 3-5 мин. Фильтруют на воронке Бюхнера и сушат на воздухе в течение 10-12 ч.

Активность ферментных препаратов протеазы, аминоацилазы и амилазы составляет 19,0, 587; 1100) ед/г, а выход 29, 71, 25% соответственно.

П р и м е р 5. Процесс осуществляют аналогично примеру 1 с той разницей, что ферментные препараты получают в промышленных условиях из водного экстракта биомассы A.oryzae, выращенной поверхностным способом. Экстракцию проводят водопроводной водой, осаждение осуществляют непрерывно при 7-12°С, препараты выделяют на се- параторе-кларификаторе при 41/0 об/мин и после лиофильной сушки подвергают дроблению.

В экстрактор емкостью /00 л, снабженный механической мешалкой, помещают 120 кг биомассы A.oryzae влажностью 40%, выращенной на пшеничных отрубях, добавляют 450 л водопроводной воды с температурой 30°С, пускают в ход мешалку и осуществляют экстракцию в течение 1 ч. Затем насосом экстракт подают на фильтр-пресс, где осуществляют отделение биошрота от вытяжки. Вытяжка поступает в напорный бак для загрязненной вытяжки, отхлаждается

0

335

до 5°С и оттуда поступает на центрифугу, где при 3000 об/мин очищается от взвешенных частиц.

Очищенная вытяжка поступает в на- порный бак очищенной вытяжки и оттуда через ротаметр в смесительную колонну диаметром 70 мм, высотой 11)00 мм. В эту же колонну из другого напорного бака через холодильник и другой ротаметр поступает этиловый спирт с температурой минус 10-12°С.

В смесительной колонне экстракт непрерывно смешивается с этанолом, при этом часть ферментов, присутствующих в экстракте, выпадает в осадок. Процентное соотношение этанола в отходящей водно-спиртовой смеси составляет 40%. Осаждение происходит 0 при 11-12 С. Суспензия ферментов в водно-спиртовой смеси из смесителя непрерывно поступает на сепаратор- кларификатор, где при 4170 об/мин отделяется от последней. 5 Осадок, представляющий собой ферментный препарат с протеазной активностью, выгружают из сепаратора-кла- рификатора на раскладочный стол, затем на кюветы. Кюветы с препаратом 0 устанавливают в камеру морозильного стола и замораживают до минус 30 С. Затем препарат сушат в течение 10- 14 ч в сублимационной сушилке марки КС-30 до температуры продукта 20°С.

Сухой препарат протеазы выгружают из сублимационной сушилки и подвергают дроблению на дробилке марки ДДК-36.

Протеолитическая активность ферментного препарата, названного Про- торизин, равна 31 ед/г. Выход препарата по активности составляет 45%.

Водно-спиртовой раствор после выделения ферментного препарата посту- ., пает в другой напорный бак, снабженный змеевиком, линиями рассола и воздуха, где при перемешивании воздухом охлаждается до 3-5°С. Из этого напорного бака водно-спиртовая смесь через TQ ротаметр поступает в смесительную колонну, где подвергается осаждению.

Осаждение ферментов, их выделение, сушка и дробление осуществляются, как описано выше. Температура осаждения составляет 8-10°С, а содержание этанола в смеси 50%.

Ферментный препарат обладает амино- ацилазной активностью, равной 650 ед/г. Выход по активности 76%.

40

5

Водно-спиртовой раствор после выеления ферментных препаратов протеа- зы и аминоацилаэы поступает в напорный бак и оттуда, охлажденный до 3- 5°С, через ротаметр поступает в смесительную колонну и подвергается осаждению. Осаждение ферментов, их выделение, сушка и дробление осуществляются, как описано выше. Температура осаждения 7-8вС, а содержание спирта в смеси 72%.

Амилолитическая. активность препарата составляет 6000 ед/г. Выход по активности 82%. ормула изобретения

Способ выделения ферментных препаратов аминоацилаэы, амилаз и проте

1

543358

аэ из Aspergillus oryzae, включающий водную экстракцию исходного сырья, фракционирование спиртом или сульфатом аммония и сушку препаратов, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса с одновременным повышением активностей ферментных препаратов, в качестве исходного сырья используют Амилоризин ПХ или поверхностную культуру его продуцента, а при фракционировании спиртом устанавливают концентрации: 35-40% для выделения протеазы, 45-50% для аминоацилазы, 72-75% для амилазы или 50%, 60% и 80% насыщения соответственно при фракционировании сульфатом аммония.

10

15