СПОСОБ ОЦЕНКИ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ МОНОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 

Способ относится к медицине (клинической иммунологии), патологии клеточного иммунитета, оценке фагоцитарной активности моноцитов крови человека, которая позволяет установить степень угнетения функциональной активности клеток.

Известен способ (аналог), позволяющий с помощью частиц латекса оценить фагоцитарную активность моноцитов крови человека (V. Myhrvold, B. Morland, Acta path. immunol. Scand, Sec, C. 1985, vol. 93, p. 43-48).

Пластиковые чашки Петри (9 см диаметром) покрываются 5 мл 2%-го раствора желатины в воде. Инкубируют 2 ч при 37^oC. Удаляют желатину. Сушат чашки при комнатной температуре. Перед использование добавляют 5 мл сыворотки человека. Инкубируют 30 мин при 37^oC. В момент использования сыворотку удаляют.

Цитратную кровь (450 мл) от здоровых доноров центрифугируют 15 мин при 1500 g при 4^o. К осадку добавляют среду RPMI (Gibco) на буфере NaHCO₃ (pH= 7,3) до объема 210 мл. Мононуклеарные клетки крови человека выделяют стандартным методом (A. Boyum, Scand. j. clin. lab. invest. 1968, vol. 21 (Suppl. 97), p. 9-29). 10 мл суспензии мононуклеарных клеток в концентрации 2 4 • 10 клеток/мл в среде RPMI с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, инактивированной при 56^oC в течение 30 мин, помещают в предварительно обработанную чашку Петри. Чашку инкубируют в течение 30 мин в 5% CO₂ при 37^oC. Для удаления неприкрепившихся клеток чашки аккуратно промывают средой RPMI, нагретой до 37^oC. Для снятия прилипших клеток добавляют 5 мл 10 ммоль этилен-диамино-тетраацетата в среде RPMI (37^oC). Чашки инкубируют 5-10 мин. Затем промывают свежей средой RPMI. Полученные клетки центрифугируют при 400 g в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют в среде RPMI с 10% инактивированной при 56^oC в течение 30 мин сывороткой человека АВ (IV) группы. Клетки помещают в платы Linbro (Linbro, Chem. Co. New Haven, Connecticut, USA) в лунки 14 мм диаметром в концентрации 0,75 • 10 моноцитов /мл.

Частицы латекса 0,8 μк (Dow) суспендируют в стерильном 0,15 М растворе NaCl. Суспензию латекса добавляют в лунку к моноцитам из расчета 50 мкл суспензии на каждый 1 мл среды RPMI. Инкубируют 60 мин при 37^oC. Отмывают средой RPMI два раза. Фиксируют 2% глютаровым альдегидом в фосфатном буфере (pH= 7,3) при 4^o С в течение 15 мин. Каплю помещают на предметное стекло. Анализ препарата проводят в фазово-контрастном микроскопе.

Следует отметить, что неопсонизированные частицы латекса плохо фагоцитируются моноцитами и недостатком известного способа, исключаемого заявленным способом, является отсутствие стадии опсонизации частиц латекса. Кроме того, известный способ удлиняет время тестирования за счет стадии предварительной обработки пластиковых чашек Петри, операций удаления прилипших к пластику клеток и отмывки клеток центрифугированием. Для учета процента фагоцитирующих клеток используют дорогостоящий фазовоконтрастный микроскоп. Полученные препараты нельзя хранить и использовать при катамнестических наблюдениях.

Наиболее точную информацию о функциональной активности моноцитов крови человека можно получать с помощью оценки фагоцитарной активности моноцитов, используя опсонизированные эритроциты барана (V. Myhrvold, B. Morland, Acta hath. immunol. Scand. Sect. C, 1985, vol. 93, p. 43-48), где мононуклеарные клетки цитратной крови человека выделяют методом A. Boyum (Scand. j. clin. lab. invest. 1968, vol. 21 (Suppl.97), p.9-29). Суспензию мононуклеарных клеток в концентрации 2 4 • 10 клеток/мл в среде RPMI и 10% инактивированной эмбриональной телячьей сывороткой помещают в пластиковые чашки Петри, покрытые желатином. Для получения моноцитов чашки инкубируют 30 мин при 37^oC в 5% CO₂. Прилипшие клетки удаляют 10 mM этилен-диамино-тетраацетатом. Клетки отмывают центрифугированием. Клеточную суспензию в концентрации 0,75 • 10 моноцитов/мл в среде RPMI с 10% инактивированной сывороткой человека AB (IV) группы помещают в лунку платы Linbro.

1% суспензию эритроцитов барана в растворе Олсвера инкубируют с 0,5 мг/мл кроличьего иммуноглобулина G (Cordis Laboratories, Miami, USA), содержащего антитела к эритроцитам барана, в течение 15 мин при 37^oC в среде RPMI. После инкубации эритроциты отмывают 3 раза в среде RPMI при 400 g в течение 10 мин. Используют в тесте фагоцитоза при разведении в среде RPMI.

В лунку плато Linbro, содержащую моноциты, помещают 1 мл 0,25% суспензии опсонизированных эритроцитов барана. Инкубируют в течение 60 мин при 37^oC. В конце инкубации среду удаляют. Лунки аккуратно промывают 2 раза средой RPMI, нагретой до 37^oC. Для лизиса непоглощенных клетками эритроцитов добавляют 0,14М раствор NHCl при 37^oC на 30 сек. Клетки фиксируют глютаровым альдегидом. Препараты микроскопируют в фазово-контрастном микроскопе Zeiss. Из наблюдавшихся 500 клеток высчитывают процент клеток, фагоцитировавших более 1 эритроцита.

К недостаткам данного метода, устраняемого данным способом относятся трудности, связанные с получением кроличьих антител к эритроцитам барана класса иммуноглобулинов G, а именно, длительное содержание кроликов и барана в виварии при повторных иммунизациях кроликов эритроцитами барана, выделение иммуноглобулина G из кроличьей сыворотки.

Основной целью изобретения является оценка степени нарушения функционального состояния моноцитов крови человека.

Дополнительной целью является упрощение метода постановки фагоцитарной реакции моноцитов (использование предметных стекол, светового микроскопа, опсонизированных частиц зимозана и возможности длительного хранения препаратов (окраска по Романовскому-Гимзе).

В отличие от прототипа решение этой задачи достигается тем, что в предлагаемом способе упрощается техника исследования фагоцитарной реакции, так как исключается необходимость предварительной обработки пластиковых чашек Петри, удаление прилипших к пластику клеток, отмывания клеток центрифугированием, использования фазово-контрастной микроскопии и содержания животных в виварии. Кроме того, появляется возможность длительно хранить препараты, полученные на предметных стеклах, после окраски по Романовскому. Объектом фагоцитоза служат опсонизированные частицы зимозана A из дрожжей S. cerevisae (Sigma. USA). Для опсонизации используют плазму здоровых доноров 0 (1) группы. К 30-50 мг зимозана A добавляют 7-10 мл плазмы и 7-10 мл раствора Хенкса. Инкубируют в термостате при 37^oC в течение 45 мин. Затем частицы 2 раза отмывают раствором Хенкса путем центрифугирования 400 g, в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют в среде 199 с гентамицином (40 мкг/мл) до конечной концентрации 0,5 мг зимозана/мл. Суспензию разливают в стерильные пластиковые ампулы по 0,2 мл. Хранить при температуре -20^oC до использования в реакции. В момент постановки метода частицы зимозана размораживают. Для получения равномерно дисперсионной смеси ресуспендируют зимозан стерильным шприцом с иглой для внутримышечных инъекций.

Из гепаринизированной венозной крови здоровых доноров выделяют мононуклеарные клетки (A.Boyum, Scand, j. clin. lab. invest. 1068. vol. 21 (suppl. 97), p. 9-29). 50 мкл мононуклеарных клеток в среде 199 с 20% эмбриональной телячьей сывороткой (инактивированной при 56^oC, 30 мин) и гентамицином 40 мкг/мл наслаивают на предметное стекло. Стекло инкубируют 30 мин при 37^oC, затем промывают в стакане с теплым раствором Хэнкса (37^oC) для удаления неприлипших клеток. На фиксированные к стеклу клетки наслаивают 50 мкл ресуспендированного зимозана A. Инкубируют препарат в течение 30 мин при 37^oC. Частицы зимозана отмывают в стакане с теплым раствором Хэнкса (37^oC). Препарат окрашивают по Романовскому. В световом микроскопе подсчитывают число моноцитов, поглотивших 1 и более частиц зимозана, из общего числа 200 исследуемых клеток.

Вычисляют фагоцитарный индекс (ФИ), равный отношению числа фагоцитирующих клеток (Кф) к общему числу исследованных клеток (Ко), умноженному на 100%

Данным способом обследовано 23 здоровых доноров в возрасте от 18 до 26 лет. Фагоцитарный индекс моноцитов крови в группе составляет 94,8±4,7%
Пример 1. Описанным методом исследовали фагоцитарную активность моноцитов крови здорового донора Сахарова В. 18 лет. Препарат, окрашенных моноцитов обработанных зимозаном, анализировали в световом микроскопе "ЛОМО" (об. 100 с иммерсией) (фото 1). В поле зрения видны моноциты крови с гематоксилинположительным ядром округлой или бобовидной формы, цитоплазма которых полностью поглотила неокрашенные сферические частицы зимозана, а также видны непоглощенные частицы зимозана. Фагоцитарный индекс в данном случае составляет 98%
Пример 2. Исследовали фагоцитарную активность моноцитов крови Антоника В. 10 лет, история болезни N 534 1992 г. больного хроническим активным гепатитов в период обострения. В световом микроскопе "ЛОМО" (об. 100 с иммерсией) (фото 2) видны гематоксилинположительные ядра моноцитов округлой или бобовидной формы, окруженные светлой цитоплазмой. В некоторых клетках видны единичные включения неокрашенных частиц зимозана (одна или две частицы). Фагоцитарный индекс в данном случае составляет 25%
Данные примеры свидетельствуют о широком диапазоне возможностей предлагаемого метода при оценке функционального состояния моноцитов крови человека. Так фагоцитарный индекс больного (25%) был существенно снижен на фоне обострения хронического активного гепатита по сравнению с показателем фагоцитарной активности здорового донора (98%).

Положительный эффект от применения способа для исследователя заключается в том, что значительно упрощается метод определения уровня фагоцитарной активности и возникает возможность длительно хранить цитологические препараты. Кроме того, сокращается время, необходимое для получения конечного результата, за счет исключения применения пластиковых чашек и необходимости снятия прилипших к пластику клеток и отмывки клеток центрифугированием. Вместо этого, предлагается использовать способность моноцитов крови прилипать к предметному стеклу в среде, содержащей 20% эмбриональную телячью сыворотку и добавлять фагоцитируемый объект (частицы зимозана) непосредственно к прилипшим клеткам без их снятия с поверхности и отмывки центрифугированием.

К недостаткам оценки фагоцитарной активности моноцитов с помощью опсонизированных эритроцитов барана (прототип), исключаемого заявленным способом, относятся трудности выявления дифференциальных различий между поглощенными эритроцитами и собственными вакуолями моноцитов, вследствие того, что плазматические мембраны эритроцитов, как и вакуоли цитоплазмы моноцитов, имеют сходную фосфолипидную структуру и одинаковую толщину мембран. В данном способе используют опсонизирвоанные частицы зимозана, которые представляют собой объект растительного происхождения (дрожжи), имеющие плотную оболочку, хорошо видимую в световом микроскопе (фото 1, 2), что уменьшает фактор субъективной оценки и повышает точность метода. Использование частиц зимозана и светового микроскопа повышает экономическую эффективность метода, так как позволяет избежать затрат на содержание животных в виварии, необходимых как источник получения эритроцитов и антител для их опсонизации, а также на приобретение дорогостоящего фазово-контрастного микроскопа Zeiss (прототип). Таким образом, данный метод является более простым, точным и экономически эффективным.

Способ оценки фагоцитарной активности моноцитов крови человека относится к медицине (клинической иммунологии), патологии клеточного иммунитета, заключается в определении функционального состояния моноцитов в реакции фагоцитоза опсонизированных частиц зимозана, которую проводят на стекле с прилипшими клетками, получаемыми из суспензии мононуклеарных клеток, выделяемых из венозной крови человека в градиенте плотности фиколл-верографина. По количеству фаготицирующих зимозан клеток, равному 94,8± 4,7%, определяют функциональное состояние моноцитов крови, как нормальное. Способ позволяет оценить функциональное состояние моноцитов крови здоровых людей и его нарушение при патологии. 2 ил.

Способ оценки фагоцитарной активности моноцитов крови человека, отличающийся тем, что из суспензии мононуклеарных клеток, прилипанием к стеклу, получают препарат моноцитов, инкубируют с опсонизированными частицами зимозана, окрашивают по Романовскому, микроскопируют в световом микроскопе, подсчитывают процент фагоцитирующих клеток и по их количеству 94,8 ± 4,7% определяют функциональное состояние моноцитов крови как нормальное.