СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА Российский патент 1996 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии, и может быть использовано в профильных учреждениях с целью оценки неспецифической антибактериальной резистентности организма.

Система нейтрофильного фагоцитоза представляет собой первую линию защиты организма от большинства патогенных и условно-патогенных бактерий.

Описано большое количество способов определения антибактериальной /фагоцитарной/ активности нейтрофилов крови в препарате с последующим внесением в него микробной взвеси, инкубированием препаратов крови, приготовлением мазков и подсчетом активно фагоцитирующих нейтрофилов.

Однако эти способы являются недостаточно объективными, так как, используя их, можно учитывать только активированные лейкоциты, в то время как активность большей части лейкоцитов, находящихся в инертном /покоящемся/ состоянии, но также обеспечивающих защиту организма от инфекции, не учитывается.

Известен "Способ определения фагоцитарно-бактерицидной активности нейтрофилов" /а.c. 709603, CCCP, МКИ A 61 B 10/00, G 01 N 1/28, 1980, публикация 15.01.80/, включающий определение фагоцитарно-бактерицидной активности лейкоцитов в препарате крови с последующим внесением в него микробной взвеси, окрашиванием, определением фагоцитарной активности по времени и количеству микробных клеток, поглощенных нейтрофилом, и бактерицидной активности по соотношению убитых ко всем поглощенным бактериям, после высушивания препарата и нанесения на него взвеси бактерий в растворе, содержащем декстран и реактив "зеленый FcF".

Несмотря на свои достоинства, данный способ регистрирует фагоцитарную активность только активированных клеток, абсолютно не учитывая потенциальную бактерицидную активность покоящегося пула нейтрофилов.

Наиболее близким к заявляемому способу по достигаемому эффекту является "Способ определение неспецифической антибактериальной реактивности у детей" /а. c. 123954, CCCP, МКИ С 01 1/30, A 61 B 10/00, опубл. 23.06.86, бюл. 23/, включающий забор крови из пальца на стабилизаторе /гепарин/, опсонизации крови зимозаном, инкубацию крови в течение 1 часа при 37^oC, приготовление мазков крови, высушивание их, окрашивание на катионные белки после обработки мазков 0,02% раствором трипсина на 0,05 н боратном буфере в течение 30 минут при 37^oC, микроскопирование, подсчет среднего гистохимического коэффициента активности реакции, оценку реакции и при снижении среднего гистохимического коэффициента ниже 0,44 условных единиц диагностику снижения неспецифической антибактериальной реактивности у детей.

Способ достаточно сложен в выполнении, позволяет оценить неспецифическую антибактериальную резистентность организма, но главный недостаток его заключается в том, что для опсонизации сыворотки крови применяется зимозан, активирующий преимущественно 1F-фактор и последовательно истощающий все компоненты альтернативного каскада комплемента. В то же время известно, что опсонизация через альтернативный путь активации комплемента характерна для большинства патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, вызывающих гнойно-воспалительные процессы в неинфекционной клинике /cтафилококки, стрептококки, энтеробактерии, псеводомонады, серратии, мистерии, легионеллы, кандиды и др./.

Кроме того, антибактериальная активность нейтрофилов по способу-прототипу оценивается по содержанию в нейтрофилах неферментных катионных белков, играющих основную роль в реализации бактерицидности, независимой от производных активированного кислорода. Убедительно показано, что антибактериальная активность нейтрофилов реализуется с помощью двух систем: кислородзависимой и независимой от производных активированного кислорода, при этом главную роль в киллинге поглощенных микроорганизмов играют кислородзависимые механизмы бактерицидности. Следовательно, в способе-прототипе не учитывается бактерицидность, связанная с производными активированного кислорода.

Цель заявляемого способа повышение точности диагностики за счет предотвращения активации комплемента по классическому пути и учета двух основных систем бактерицидности нейтрофилов.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве объекта фагоцитоза используют культуру бактерий Serratia marcescens, опсонизируют бактериальную взвесь сывороткой здоровых лиц, инкубируют опсонизированную и неопсонизированную культуру бактерий с лейкоконцентратом больных, исследуют суммарную цитохимическую активность миелопероксидазы и катионных белков до и после инкубации, рассчитывают индекс стимуляции нейтрофилов и при величине этого индекса 0,5 и ниже определяют снижение антибактериальной резистентности организма.

Способ осуществляют следующим образом.

I. Подготовка культуры бактерий Serratia marcescens.

Бактерии Serratia marcescens включены как типовой вид в род Serratia семейства Enterobacteriaceae. Эти бактерии представляют собой подвижные палочки, перитрихи, многие штаммы этого вида образуют розовый, красный или фуксиновый пигмент продигиозан, недиффундирующий в среду. Образование пигмента является характерным признаком рода Serratia, на пигментообразование S. marcescens влияют условия культивирования и среды.

24-часовую культуру бактерий S. marcescens, выращенную на мясо-пептонном агаре, суспендировали в растворе Хенкса. Полученную взвесь стандартизировали по оптическому стандарту мутности, соответствующему концентрации бактерий 2•10⁹ в 1 мл взвеси. После этого двухмиллиардную взвесь бактерий смешивали в равных объемах с 10% сывороткой доноров, инкубировали 30 минут при 37^oC, трижды отмывали при 5000 g и ресуспендировали в растворе Хенкса.

II. Стимуляцию бактерицидности оценивали по цитохимическим реакциям на миелпероксидазу и содержание катионных белков. Ход реакции: смешивали в двух пробирках 0,1 мл суспензии лейкоцитов /2,0 x 10⁶ клеток в 1 мл/ и 0,1 мл опсонизированной культуры бактерий. В контроле /2-я пробирка/ использовали неопсонизированную культуру бактерий.

Затем соответственно из 2 пробирок готовили по 2 мазка, высушивали их и проводили постановку цитохимических реакций.

IIА. Выявление миелопероксидазы в нейтрофилах крови проводили по методу Loele. После фиксации мазков крови в смеси, состоящей из 1 части 40% формалина и 9 частей 96^o этилового спирта, в течение 1 минуты мазки споласкивали в дистиллированной воде. Затем на них наносили при комнатной температуре инкубационную смесь следующего состава:
бензидин 40 мг
40^o этиловый спирт 10 мл
3% раствор перекиси водорода 0,02 мл
Мазки промывали проточной водой, высушивали и микроскопировали. В местах локализации миелопероксидаза в клетках опpеделялись гранулы желтовато-коричневого цвета.

Оценку цитохимических реакций проводили на основании подсчета 100 нейтрофилов с учетом интенсивности окраски в цитоплазме по четырехбалльной системе. Интенсивная окраска соответствовала высокому /+++/, средняя /++/ - умеренному, слабая /+/ незначительному содержанию вещества в клетке. Отрицательная обозначалась как 0.

Средний гистохимический коэффициент /СГК/ вычисляли по формуле Астальди, Верга:

где цифры 3, 2, 1, 0 степень интенсивности окраски /от +++ до 0/, буквы число клеток с той или иной интенсивностью окраски.

IIБ. Определение содержания катионных белков в цитоплазме лейкоцитов проводили по методу: высушенные, свежеприготовленные мазки фиксировали 60 секунд 5% раствором сульфосалициловой кислоты, тщательно промывали их дистиллированной водой, окрашивали 2 минуты 0,1% раствором бромфенолового синего в 0,05 М боратном буфере /pH 8,2/, промывали мазки в 3 сменах этого же буфера по 2 минуты, высушивали и докрашивали ядра 1% раствором сафранина в течение 60 секунд. Мазки промывали проточной водой, высушивали и микроскопировали. Активность катионных белков выражали в условных единицах с вычислением среднего гистохимического коэффициента.

Затем рассчитывали индекс стимуляции нейтрофилов:

где A активность фермента и содержание катионных белков после инкубации лейкоцитов с опсонизированной культурой бактерий; В то же с неопсонизированной культурой бактерий.

Например: активность миелопероксидазы после инкубации с неопсонизированной культурой бактерий составила 2,3; при опсонизации бактерий 2,9.

Активность цитохимической реакции на катионные белки после инкубации крови с опсонизированной культурой бактерий оказалась равной 3,0, тогда как при использовании во время инкубации неопсонизированной культуры бактерий - 1,7.

Таким образом, индекс стимуляции нейтрофилов составил:

У здоровых лиц колебания индекса стимуляции нейтрофилов колебались от 0,85 до 1,1.

Обоснованием достоверности заявляемого способа являются данные литературы, свидетельствующие о том, что Serratia marcescens, редко встречаясь у человека, вызывает минимальное антителообразование, что сводит практически к нулю активацию комплемента по классическому пути, а приводит к выраженной активации альтернативного каскада комплемента.

В качестве конкретного осуществления способа приводим выписки из историй болезни.

Пример 1. Больная О-к поступила в гематологическое отделение по поводу хронического миелолейкоза в стадии выраженных клинических проявлений. При поступлении проведено исследование функции нейтрофилов. Получены следующие данные:
Активность миелопероксидазы после инкубации нейтрофилов с опсонизированной культурой бактерий 2,3; активность миелопероксидазы после инкубации лейкоцитов с неопсонизированными бактериями 1,9. Активность цитохимической реакции на катионные белки после инкубации нейтрофилов с опсонизированными бактериями 1,7; то же после инкубации лейкоцитов с неопсонизированной культурой 1,44. Индекс стимуляции нейтрофилов в данном случае составил

В процессе лечения у больной на фоне снижения антибактериальной резистентности организма развилась бронхопневмония.

Пример 2. Больной Х-ко поступил в гематологическое отделение по поводу хронического миелолейкоза в стадии развернутых клинических проявлений. Функциональная активность нейтрофилов: Активность миелопероксидазы после инкубации нейтрофилов с опсонизированной культурой бактерий 2,76; в контроле /с неопсонизированными бактериями/ 2,12. Активность цитохимической реакции на катионные белки после инкубации нейтрофилов с культурой бактерий после их опсонизации 1,81, в контроле /c неопсонизированными бактериями/ 1,29. Таким образом, индекс стимуляции нейтрофилов составил:

/то есть оказался ниже 0,5/. Признаков инфекционно-воспалительных процессов у данного больного в процессе проводимой цитостатической терапии не наблюдалось.

Апробация способа проведена на кафедре терапии и гематологии Киевского института усовершенствования врачей и кафедре микробиологии Киевского медицинского института. Исследования проводились на больных /89 человек/ с лейкозным процессом и 30 здоровых лицах.

Проведен сравнительный анализ точности определения антибактериальной резистентности организма с использованием способа-пpототипа и заявляемого способа. Так, при использовании способа-прототипа ошибка в определении антибактериальной резистентности организма составила 20,22% /18 человек/, тогда как при применении заявляемого способа ошибка наблюдалась у 9 /10,1%/. Следовательно, точность заявляемого способа повышена в 2 раза.

Использование: в области медицины, в частности в иммунологии. Сущность изобретения: перед подготовкой мазков готовят культуру бактерий Serratia marcescens для использования ее в качестве объекта фагоцитоза, опсонизируют бактериальную взвесь сывороткой здоровых лиц, инкубируют опсонизированную и неопсонизированную культуру бактерий с лейкоконцентратом больных, исследуют суммарную цитохимическую активность миелопероксидазы и катионных белков до и после инкубации, рассчитывают индекс стимуляции нейтрофилов и при величине этого индекса 0,5 и ниже определяют снижение антибактериальной резистентности организма. Способ позволяет повысить точность определения антибактериальной резистентности организма.

Способ определения неспецифической антибактериальной резистентности организма путем опсонизации крови и ее исследования, отличающийся тем, что в качестве объекта фагоцитоза используют культуру бактерий Serratia marcescens, опсонизируют бактериальную взвесь сывороткой здоровых лиц, инкубируют опсонизированную и неопсонизированную культуру бактерий с лейкоконцентратом больных, исследуют суммарную цитохимическую активность миелопероксидазы и катионных белков до и после инкубации, рассчитывают индекс стимуляции нейтрофилов и при величине этого индекса 0,5 и ниже определяют снижение неспецифической антибактериальной резистентности организма.