Способ определения СЗв рецепции нейтрофилов человека Советский патент 1987 года по МПК G01N33/53 

11361489

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для определения наличия СЗв рецепторов на нейтрофилах и оцен- g ки состояния защитной системы организма.

Целью изобретения является упрощение способа.

Способ осуществляют следующим об- Ш разом4

Используют коммерческий сефадекс G-25, который запивают дистиллированной водой, затем доводят до концентрации 100 мг/мл. Дня опсонизации 16 сефадекса используют лиофилизирован- ный пул сывороток крови. Смешивают 1 мл взвеси сефадекса и 1 мл цельной сыворотки, инкубируют 30 мин при

ратах камеры Горяева из контрольной пробы,

В опыте нейтрофилы активнее присоединяются к сефадексу , а меньшее их количество по сравнению с контролем остается в надосадке. Разделив количество нейтрофилов в опыте на количество нейтрофилов в контроле и умножив на 100, получают процент клеток, оставшихся в надосадке. Следовательно, оставшиеся клетки (от 100% вычесть % клеток в супернатан- те) присоединяются к сефадексу - это и есть % клеток, содержащих рецепторы к СЗв-фактору комплемента. I, .- - .

Пример 1. Проводят оценку

37°С трижды отмывают физиологическим 20 СЗв-рецепторов нейтрофилов у иссле- раствором, взвешивают в исходном дуемого донора, 21 г. В стерильных объеме (рабочая концентрация опсони- -условиях из вены получают 2,5 ил кро

зированного сефадекса 10 мг/мл). Хранят при 4 С. Нейтрофилы выделяют из крови здоровых доноров в двойном градиенте плотности фиколл-верографин .(1,116 и 1,077 г/см ), суспендируют в среде 199 в концентрации клеток 5 млн./мл. Затем смешивают по 0,2 мл взвеси опсонизированного сефадекса и нейтрофилов (контролем служит реакция с неопсонизированным сефадек сом), инкубируют 30 мин при 37.С. После инкубации сефадекса с нейтрофи лами в каждую пробирку заливают по 3 -мл среды 199. Через 2 мин, когда гранулы сефадекса (присоединившие нейтрофилы и без них } осядут на дно пробирки, подсчитывают число клеток в супернатанте с помощью камеры Горяева. Подсчет клеток для опытной. (с опсонизированным сефадексом) и контрольной (с неопсонизированным сефадексом) проб ведется по всей камере Горяева (в 225 квадратах). Показатель СЗв рецепции нейтрофилов (ПРИ) - % нейтрофилов, содержащих рецепторы к СЗв, выражается по формуле

ПРН СЗв 100

- (-2™1 ,00), контроль

количество нейтрофилов,

подсчитанных в 225 квад- gg ратах камеры Горяева из опытной пробы; количество нейтрофилов, подсчитанных в 225 квад ос

ратах камеры Горяева из контрольной пробы,

В опыте нейтрофилы активнее присоединяются к сефадексу , а меньшее их количество по сравнению с контролем остается в надосадке. Разделив количество нейтрофилов в опыте на количество нейтрофилов в контроле и умножив на 100, получают процент клеток, оставшихся в надосадке. Следовательно, оставшиеся клетки (от 100% вычесть % клеток в супернатан- те) присоединяются к сефадексу - это и есть % клеток, содержащих рецепторы к СЗв-фактору комплемента. I, .- - .

Пример 1. Проводят оценку

0

g

ви. Нейтрофилы выделяют путем центрифугирования в двойном градиенте

5 плотности (1,116 и 1,077 г/см) фиколл-верографин. После двухкратного отмывания в среде 199 (общий объем 20 мл) клетки ресуспендируют в том же растворе. Конечная концентрация

0 клеток нейтрофилов 5 млн/мп. Все

манипуляции проводят в силиконирован- ной стеклянной посуде,

1 мл взвеси сефадекса смешивают с 1 мл цельной сыворотки, инкубируют

с 30 мин при 37, трижды отмывают физиологическим раствором ( объем 15 мл) и взвешивают в физиологическом растворе, конечная концентрация опсонизированного сефадекса 10 мг/мл, В контроле используют неопсонизиро- ванньп сефадекс. Инкубация 30 мин при . Во время инкубации сефадекс с нейтрофилами. надосадок переливают в другую пробирку, предварительно измерив его объем, к осадку добавляют еще 3 мл среды 199 для отмывки от свободных (несвязанных) нейтрофилов. Определяют общий объем надосадка. В камере Горяева подсчитывают число клеток в супернатанте после инкубации нейтрофилов с опсонизированным (опыт) и неопсонизированным (.контроль) сефадексом. Опыт 26, контроль 88, ПРН СЗв 71%,

Использование предлагаемого способа определения СЗв рецепции нейтрофилов позволяет упростить способ за счет снижения количества необходимой донорской крови при использовании

5

0

свежих донорских эритроцитов в методе определения СЗв рецепторов (Г).

Кроме того, способ обладает хорошей воспроизводимостью, стабильностью тест-системы (срок годности сефадек- са, покрытого комплементом, 12 мес и более), может применяться в клинической практике для динамического наблюдения за больными.

Формула изобретения

Способ определения СЗв рецепции нейтрофилов человека, включающий инкубацию нейтрофнлов с носителем, обработанным комплементом, и подсчет клеток, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве носителя используют се- фадекс.

Изобретение относится к иммуно- логии. Цель изобретения - упрощение способа. Взвесь сефадекса смешивают с цельной сывороткой, инкубируют и отмывают. После инкубации сефадекса с нейтрофилами в пробирки добавляют среду 199. Затем подсчитывают число клеток в супернатанте. Способ может бцть использован для оценки состояния защитной системы организма.