Способ получения мутеинов гирудина Советский патент 1991 года по МПК C12N15/15 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при создании фармацевтических композиций.

Цель изобретения - повышение сродства мутеинов к тромбину и упрощение способа.

Пример 1. Конструкции различных вариантов гирудина-2 (Г2) мутагенезом in vitro.

Для осуществления направленного мутагенеза in itro фрагмент ДНК клонируют в репликативную форму фага, геном рекомби- оантного фага выделяют и подвергают гибридизации с синтетическим олигонукле- отидом, который несет мутированную последовательность. Этот олигонуклеотид служит затравкой синтеза комплементарной нити. Полученную таким образом двуни- тевую ДНК используют для трансформации бактерий, которые будут продуцировать фаг, несущий искомую мутацию.

Плазмида pTG720 представляет вектор экспрессии гирудина в E.coll. Плазмиду

pTG730 получают из pTG720 путем присоединения сайта EcoR1 за кодирующей последовательностью гирудина.

Фрагмент Cla1-EcoR1 покрывает всю область, кодирующую гирудин, без нескольких 5-концевых кодонов. Этот фрагмент Cla l-EcoRI клонируют между сайтами Асс1 и EcoR1 фага М13, называемого М13Т 131. Фаг, происходящий из M13TG131 и содержащий последовательность гирудина, назван M13TG1919.

Синтезируют три олигонуклеотида, каждый из которых способен составить пару с последовательностью 51-ГТАЦАЦЦГААЦН- ЦТГАААГ-31 в M13TG1919, кроме ее центральной области, которая соответствует желаемой мутации. Последовательности этих нуклеотидов являются следующими:

TG435 51-ЦТТТЦАГГГТГЦГГТГТАЦ-31,

TG436 Б ЦТТТЦАГГПТЦГГТГТАЦ-З1, . ТС43751-ЦТТТЦАГТГЦГЦГТТГТАЦ-31.

Эти олигонуклеотиды предназначены для осуществления замещения кодона ААЦ

Ё

(асн) в М13Т1919 на ЦАЦ(гис) или ААА(лиз), или ЦГЦ(арг) соответственно.

120 пмоль каждого олигонуклеотида фосфорилируют в 100 мкл реакционной среды и примерно 20 пмоль фосфорилировен- ного олигонуклеотида гибридизуют с 1 пмоль однонитевой ДНК фага М13Т1919.

После гибридизации смеси обрабатывают полимеразой Кленова и лигазой фага 14 и используют для трансфекции штамма E.coli 71/18 (mutL). Отбирают клетки, которые образуют ионы медленного роста, коло нии пересеивают на полную среду, переносят на бумагу 540 для отбора клеток, имеющих мутированные фаги.

Отбор осуществляют гибридизацией с олигонуклеотидом - затравкой. Таким образом получают три новых фага, имеющих искомую мутированную последовательность: M13TG1921 (асн47- арг), M13TG1924 (асн 47 гис)и M13TG1925 (асн47 - лиз).

С другой стороны повторяют тот же тип эксперимента с олигонуклеотидом Т434 последовательности5 -АТТГТААЦТЦТТСТТСТГ-31. Этот олигонуклеотид гибридизуют с последовательностью 5 - ЦАГААГААТАТТТАЦААТ, локализованной в области З1 последовательности, кодирующей Г2 с неспаренным триплетом, предназначенным для замены кодона ТАТ(тир6 на ГАГ(глу). Таким образом получают мутированный фаг, соответствующий M13TG1922 (тир63- глу).

Пример 2. Замещение фрагмента Pstl-HInd III и (0,6 т.п.о.) в pTG 1828 на мутированный фрагмент.

Плазмида pTG1828 несет последовательность, кодирующую гиридин, которой предшествует последовательность гена полового ферромонэ-альфа дрожжей MFL все это под контроль промотора PGK. Последовательность WFL и гирудина проходят стадию синтеза и созревания в дрожжах, таким образом продуцированный гирудин находится в культуральной среде.

Эту плазмиду используют для получения последовательностей мутированного гирудина вместо нативного гирудина.

Гидролиз рестриктазами Pstl и Hlndlll PTG 1828 высвобождает пять фрагментов размером примерно 3,8; 1.9: 1,5; 1,1 и 0,6 т.п.о. соответственно. Последний фрагмент содержит только один сайт Асс1 и один сайт EcoRL Область, ограниченная этими двумя сайтами содержит всю последовательность гирудина без нескольких 51-концевых кодо- нов. Фрагмент Hindlll Pst 0,6 т.п.о. вставлен между сайгами Hlndlll и Pst1 вектора, который не имеет ни сайта EcoR1, ни сайта Асс1.

Таким образом плазмида pTG1960 име ет один сайт Асе 1 и один сайт EcoR1, локв лизованные в начале и конце последов тельности гирудина.

Большой фрагмент ДНК, из последовательности гирудина, очищают в геле и смешивают с продуктом переваривания Асс1 - EcoR1 репликативной формы каждого из мутированных фагов, описанных в примере 1,

0 чтобы реконструировать комбинацию про- про-гирудин с новыми вариантами Г2, полученными направленной мутацией. Отобраны четыре новых плазмида: pTG1963 (асн47-- арг), pTG1964 (тир63- глу), рТ1965

5 (асн47- гис) и рТС1966(асн4Д. лиз), которые отличаются от pTG1960 только мутированными кодонами.

Эти последовательности, несущие мутированные кодоны, могут быть выделены в

0 виде фрагментов Pstl Hlndlll и повторно клонированы в вектор pTG1826 вместо исходного фрагмента Pst1-Hindlll.

Таким образом получают четыре новых плазмиды: pTG1977 (асн4 арг), pTG1978

5 (тир63- У глу), pTG 1979 (асн47, гис) и pTG 1980 (асн47 лиз), которые отличаются от pTG1828, описанной выше, только мутациями.

Пример 3. Клетки дрожжей TGVIsp4

0 трансформируют с помощью ДНК pTG1977, pTG1978. pTG1979, pTG1980, Трансформанты получают в каждом случае и получают четыре штамма TGVIsp4 pTG1977, TGVIsp4 PTG1978, TGVIsp4 pTG1979 и TGVIsp4

5 pTG1980. Сравнивают продуктивность по гирудину этих четырех штаммов и TGVIsp4 PTG1828.

Засевают 20 мл культуры, после 48 ч выращивания при 30°С клетки центрифуги0 руют (5000 об/мин, 5 мин) и анализируют надосадочные жидкости.

Культуру TGVIsp4 pTG881 (плазмида, не несущая последовательности, кодирующей Г2) используют в качестве контроля.

5Активность надосадочных жидкостей

оценена по их ингибирующему действию на активность тромбина (протеолитическая активность на синтетический субстрат).

Установлено, что ингибирующее дейст0 вне. производимое вариантами арг4 и лиз , не меньше действия нативного Г2. Варианты глу63 и гис47 обладают несколько меньшим ингибирующим эффектом.

Пример 4. Ингибирование действия

5 тромбина.

Используют варианты гирудина, очищенного до 95%, и чистый человеческий тромбин, имеющий процент активности, измеренный титрованием активных центров, оавный 92%. Концентрации тромбина одимаковы во всех измерениях и равны 5,5 -10 М. Реакцию проводят в буфере состава: 0,05 М натрий, рН 7,9, 0,18 М KCI и 0,1 % ПЭГ при 37°С. В течение 2 мин проводят преинкуба- цию для тромбина и гирудина, потом реак- цию запускают в ход с субстратом.

В табл. 1 приведены величины, определенного экспериментально, количества гирудина, необходимого для ингибирования 95% такого же количества человеческого тромбина (5,5 М).

Таким образом, ясно, что требуется примерно в четыре раза меньше гирудина Г2 - арг и Г2 - лиз , чтобы ингибировать то же количество человеческого тромбина, в срав- нении с гирудином Г2.

Следовательно, предлагаемые варианты обладают значительно улучшенными ин- гибирующими свойствами по отношению к тромбину.

Пример 5. Фармакологическое изучение двух вариантов гирудина - рекомби- нантных Г2 и Г2-Лиз в сравнении со стандартным гепарином.

Цель изучения.

Оценить два варианта рекомбинантно- го гирудина и сравнить их антитромбиче- скую эффективность со стандартным гепарином.

Экспериментальные условия.

Антитромбическую специфическую активность двух рекомбинантных гирудинов в физиологической сыворотке определяют по ингибированию протеолитической активности тромбина на хромозные.

Антикоагулирующую активность двух гирудинов сравнивают In vitro в плазме крысы и кролика по продолжительности тром- бинового времени и эффекту анти-Ила хромогенным методом.

Кинетику плазматического исчезновения гирудина после внутренней инъекции большого объема наблюдают путем измерения влияния анти-Ила с помощью тромби- нового времени и хромогенным методом с помощью калибровочных кривых.

Полученные плазматические концентрации после 30 мин непрерывной внутривенной перфузии у кролика определяют по тем же методикам.

Антитромбическую активность двух вариантов гирудина и стандартного гепарина изучают на модели Весслера на кроликах и на крысах с тромбопластином как тромбо- генным агентом и на модели стаза у кролика. Лекарство вводят кролику внутривенно путем непрерывной перфузии большого объема.

Модель Весслера на кролике.

Используют самцов новозеландских кроликов, весящих 2,5-3 кг. После анестезии с помощью внутривенной инъекции пен- тобарбитала натрия (30 мг/кг) каннилируют левую сонную артерию и изолируют две яремных вены, накладывают две слабые лигатуры на каждую из них на расстоянии 2.5 см одна от другой. Затем кролики получают или физиологическую сыворотку или растворы гирудина или гепарина непрерывной перфузией в течение 30 мин при расходе 2,5 мл/ч. За 2 мин до конца перфузии берут пробы артериальной крови, чтобы определить содержание антикоагулянтов в плазме. За 1 мин до конца перфузии делают инъекцию человеческого стандартизованного тромбопластина в дозе 600 нг/кг точно в течение 30 с в аорту через сонную артерию. Спустя 30 с перфузию прекращают и образуют застой крови, сжимая лигатуры двух сегментов вен в течение 15 мин. Вскрывают яремные вены и извлекают тромбы, промывают в физиологической сыворотке и взвешивают после тампонирования на фильтровальной бумаге.

Модель Весслера на крысе.

Используют самцов крыс Сираг-Доулей (СД-СОВ) весом примерно 300 г. После анестезии пентобарбиталом натрия интрапери- тонеальным путем (30 мг/кг) и срединной лапаротомии высвобождают нижнюю полую вену на 1 см из почечного перекрестья. Накладывают две гибкие лигатуры на расстоянии 1 см.

Испытуемые образцы, разбавленные физиологической сывороткой, вводят внутривенно одним объемом дозой 1 мл/кг за 5 мин 40 с или за 1 мин (гепарин) до реализации венозного стаза. За 40 с до этого стаза вводят тромбогенный агент в дозе 25 мг/мл/кг в вену пениса в течение 30 мин. Через 10 с после окончания инъекции создают стаз, зажимая обе лигатуры, сначала проксимальную, затем дистальную. Состояние стаза выдерживают в течение 10 мин, потом тромб извлекают, погружают в 0,38%-ный раствор цитрата, сушат на бумаге досуха и взвешивают на следующий день после сушки в течение 1 ч при 50°С.

Модель тромбоза для застоя крови у кролика.

Используют самцов новозеландских кроликов весом 2,5-3 кг. После анестезии путем внутривенного вливания 30 мг/кг пентобарбитала натрия канюлируют левую сонную артерию и изолируют две яремные вены, на каждую из них накладывают две слабые лигатуры на расстоянии 2,5 см друг от друга. Затем кроликам вводят или физиологическую сыворотку, или растворы гирудина, или гепарина непрерывной перфузией в течение 30 мин при расходе 2,5 мл/ч. За 2 мин до окончания перфузии делают отборы артериальной крови, чтобы определить плазматическое содержание антикоагулянтов. После прекращения перфузии создают состояние стаза, зажимая четыре лигатуры (сначала проксимальную, затем дистальную). Стаз сохраняют 2 ч, потом вскрывают яремные вены и извлекают тромбы, промывают в физиологической сыворотке и взвешивают после тампонирования на бумажном фильтре.

Результаты.

Для каждого препарата маточного раствора с концентрацией 1 мг/кг специфическая антитромбиновая активность обоих вариантов гирудина по отношению к человеческому и бычьему тромбинам приведены в табл.2.

Специфическая антитромбиновая активность варианта гирудина Г2 составляет +/-15000 АТЕ/мг и для варианта Г2-Лиз47 составляет +/-19000 АТЕ/мг. Эти специфические активности превышают ожидаемые. Специфическая активность идентична для человеческого и бычьего тромбинов.

Антикоагулирующая активность в плазме крысы и кролика эквивалентна при малых концентрациях обоих гирудинов. Активность варианта Г2-Лиз47 значительно выше при более высоких концентрациях. Количество остаточного тромбина в плазме, определенное с помощью хромогенного субстрата, сравнивают после добавления обоих гирудинов до 60 АТЕ/мл. Для лучшей нейтрализации следов остаточного тромбина вариант Г2-Лиз является более эффективным. Это выражено в разнице значений К.

Кинетика исчезновения обоих гирудинов в плазме после внутривенной инъекции большого объема оказывается сравнимой при определении ее хромогенным методом, но несколько различается три определения ее по тромбиновому времени (табл.3).

Гирудины исчезают согласно двум экспонентам. На первой фазе(распределение) с периодом полураспада, равным 3 мин, исходное количество за 5 мин снижается до 60% для обоих гирудинов. На второй фазе

период полураспада равен 16 мин, для Г2-Лиз и 28 мин для Г2, если расчет ведут с учетом тромбинового времени, и 28 и 30 мин соответственно, если используют хромогенный метод. Стандартный гепарин исчезает согласно одной экспоненциальной фазе, период полураспада равен 9 мин.

Концентрации двух вариантов гирудина в плазме, полученные после 30 мин непрерывной перфузии внутривенно кролику, находятся в прямой зависимости от перфузируемых доз (см. табл.4). Антитромбиновые эффекты. На основании фармакологических анализов видно, что при непрерывной перфузии кролику вариант рекомбинантного гирудина Г2-Лиз имеет более высокую ан- титромбиновую активность, чем Г2 и гепарин. Фармакокинетика обоих вариантов

гирудина является идентичной.

Исследования показывают, что геморрагическая опасность у кроликов или время кровотечения у крыс, получивших Г2-Лиз , ниже, чем у получивших стандартный гепарин, для каждого вида животного при эквивалентных дозах для модели тромбоза.

Таким образом, изобретение позволяет получить рекомбинантные мутанты гирудина, обладающие высоким фармакологическим эффектом.

Формула изобретения Способ получения мутеинов гирудина, предусматривающий получение фрагмента

ДНК, кодирующего гирудин с помощью сай- тспецифического мутагенеза, конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей мутеины гирудина, путем клонирования фрагмента в вектор, трасформацию полученной ДНК штаммов-реципиентов, культивирование трансформированных штаммов, выделение и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения сродства мутеинов к тромбину и упрощения способа, получают фрагмент ДНК, в котором кодон для аминокислоты в 47 позиции природной формы HU2 заменен на кодон для Lys или Arg, конструируют рекомбинантные плазмидныеДНК, рТС197илирТ61980, а в качестве реципиента используют Sachomicus cerevislae TGVIsp4.

1687032

10 Таблица 1

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при создании фармацевтических препаратов. Цель изобретения - повышение сродства мутеинов к тромбину и упрощение способа. Для этого с помощью фрагмента ДНК, в котором кодон для аминокислоты в 47 позиции природной формы гирудина заменен на кодон для лизина или аргинина, конструируют рекомби- нантные плазмидные ДНК pTG197 или pTG1980 и трансформируют ими реципиен- тный штамм дрожжей S cerevlsial TGVI sp.4. В результате получают штаммы, продуцирующие мутантныи гирудин. 3 абл.

ТТ - тромбиновое время. SC - хромогенный субстрат

Таблица2

Таблица 3

Таблица 4