Изобретение относится к генной инженерии, в частности к способу получения полипептида со свойствами гирудина и к штаммам Saccharomyces cerevislae, экс- прессируюа им предшественник гирудина.
Известно, что слюнные железы медицинских пиявок содержат полипептид, называемый гирудином, который является специфичным и эффективным ингибитором тромбина. Однако проблемы, связанные с выделением и очисткой гирудина, ограничивают его широкое применение в медицине.
Известно получение гирудина клонированием натурального гена пиявки, кодирующего гирудин, известна и экспрессия гирудина в микроорганизме E.coli 1
Однако использование гирудина, полученного из кишечной палочки, требует устранения пирогенных примесей и связано с проблемой очистки гирудина, используемого в клиниках.
Кроме того, гирудин, синтезированный через E.coli, остается внутриклеточным и должен, следовательно, очищаться, исходя из очень большого количества пептидов E.coll. По этим причинам представляет интерес экспрессия гена гирудина в дрожжах, которые не продуцируют пирогенных веществ или веществ, токсичных для человека,
XI XI
ю сл о
00
и которые способны выделять протеины в питательную среду.
Известен также способ очистки или экстракции природного гирудина, полученного из пиявок 2.
Недостаток способа - необходимость осуществления стадий очистки или экстракции, что делает способ экономически невыгодным.
Цель изобретения - упрощение способа.
Способ основан на методах генной инженерии с получением рекомбинантного гирудина с использованием других типов микроорганизмов, отличающихся от Е.соН.
Изобретение относится к штаммам дрожжей Saccharomyces cerevisiae CNCM 1-441 и CNCM-442, окспрессирующих предшественник гирудина. Изобретение относится также к способу получения полипептида со свойствами гирудина, оа- ключающемуся в том, что конструируют ре- комбинантные плазмидные ДНК pTG 1818 или pTG 886, трансформируют полученными плазмидамиштаммдрожжей
Saccharomyces cerevfslas TGY sp4, а очищенный белок активируют путем обработки 1 мл раствора цианбромида с 30 мг/мл в 70%-ной муравьиной кислоте.
Используемые штаммы депонированы в Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM) при Институте Пастера (Франция) и имеют следующее таксономет- рическое описание:
а)TGYI sp4 PTG 1818: Saccharomyces cerevisiae.
Штамм TGYI sp4 (Mat L ura 3-251-383- 328-his-3-11-15), трансформированный в ига1 плазмидой pTG 1818; депонирован под Мг 1-441.
б)TGY sp pTG 886: Saccaromycos cerevisiae.
Штамм TGY sp4 (Mat L ura 3-251-373-his- 3-11-15), трансформированный в ura4 плазмидой pTG 886; депонирован под N 1-442.
Исходный штамм TGYI sp4, который трансформируют рекомбинантными векторами, является штаммом, представляющим генотип: Mat, his 3-11,15, ига 3-251,373,328, что выражается фенотипом (his), (ura). Этот штамм получают скрещиванием штаммов Л FR ига 3 (Mat Л. ига 3-251, 373, 328) и GRF 18 (Mat, his3 11-15 leu 2, 3-112).
Введение плазмид, с одной стороны, приводит к штамму фенотипа ига , а, с другой стороны, обеспечивает экспрессию предшественника гирудина.
Условия хранения.
Полная стандартная среда (УРС), содержащая 20% глицерина (V/V). Консервация в
этой среде при -8°С. Состав среды дрожжевой экстракт Difco 1 %, 2% глюкозы.
Среда культивирования - минимальная среда (отбор прототрофов по урацину), содержащая гистидин 40 мг/мл или смесь ами- нокислот (например, казаминокислоты 0,5%).
Состав минимальной среды (YNBG): стандартный Васто Yeast Nitrogen Base
0 (Difco) без аминокислот 6,7 г/л, глюкоза 10 г/л, температурные условия 28°С.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Конструкция pTG 822.
5 Фрагмент кДНК гирудина HY-2 экстрагируют из геля после обработки плазмиды pTG 717 с Pst 1, гидролизуют одновременно ферментами Hlnf I и Aha 111. Фермент Hinf I вырезает концевую часть первого кодона
0 последовательности зрелого гирудина HY- 2. Фермент Aha III вырезает приблизительно 30 пар концевых оснований (3) стоп-кодона последовательности гирудина. Полученный таким путем фрагмент Hinf
5 l-Aha III выделяют на агарозном геле, затем элюируют из этого геля.
Последовательность, кодирующую зрелый протеин, вводят в вектор pTG 880. Вектор pTG 880 является производным вектора
0 pTG 838. Плазмида pTG 838 идентична pTG 833, за исключением того, что сайт Bgl II расположен около стоп-кодон транскрипции PGK. Этот сайт удаляют воздействием полимеразы Кленова, чтобы получить pTG
5 838.
Плазмида pTG 833 является челночной плазмидой дрожжей - Е.соП. Основные элементы этой плазмиды следующие: ген uRA3 как маркер отбора в дрожжах, источник ре0 пликации плазмиды 7ц. дрожжей, ген устойчивости к ампициллину и источник репликации плазмиды pBR 322 E.coli (эти два последних элемента обеспечивают амплификацию и отбор этой плазмиды в кишеч5 ных палочках), фланговый участок в 5 гена PGK дрожжей с кодирующей последовательностью этого гена до сайта Sail, фрагмент Sall-Pvu II pBR 322 и стоп-кодон гена PGK.
0 Плазмиду pTG 880 конструируют на основе pTG 838 введением короткого участка поликлинкера (происходящего от бактериофага М13) в pTG 838, вырезанного с помощью EfcoRI и Bglll, что позволяет
55 разместить ряд сайтов клонирования, в таком порядке: Bglll, Pst I, Hind III, Bam III, Sma I и EcoRI, непосредственно после участка 5 гена PGK дрожжей. ДНК плззмиды pTG 880 обрабатывают Bgll и Sma I, и большой фрагмент, образующийся от этого гидрелиза, выделяют и элюируют из геля. Фрагмент Hinfl-Aha III pTG 717, который содержит основную часть кодирующей последовательности гирудина НУ-2, смешивают с pTG 880, одновременно с 3 синтетическими нуклеотидами, предназначенными для воспроизведения NH2 концевого участка последовательности гирудина, и которые связывают сайт Bglll вектора с сайтом Hlnf I фрагмента, содержащего гирудин. Эту смесь лигируют. Получают плазмиду pTG 882.
Эта плазмида служит для трансформации клеток дрожжей с целью получения гирудина под контролем промотора PGK. Однако не обнаружено никакой активности гирудина в сырых экстрактах клеток, трансформированных этим вектором. Причина отсутствия получения активного гирудина еще непонятна. Тем не менее конструкция pTG 882 служит источником кодирующей последовательности гирудина.
Пример 2. Сначала фрагмент Bglll- EcoRI (230bp) в конструкции pTG 882, содержащий последовательность гирудина, переносят в бактериофаг М13т р8 между сайтами BamHl и EcoRI. Это дает фаг M13TG 882, из которого можно выделить фрагмент EcoRI-Hindlll (приблизительно 245 вр). Этот фрагмент содержит целиком кодирующую последовательность гирудина НУ-2, причем участок слияния BamHI/Bglil и склеивающие концы (Hindlll-EcoRI) позволяет осуще- твлять клонирование данного фрагмента в векторе pTG 881.
Плазмида pTG 881 °(10 кб) является челночной плазмидой E.coli (дрожжи, реплицирующие автономно одновременно в E.coll и штаммах Saccharomyces erevisiae, и varum и carlbergensis).
Введение этой плазмиды в E.coli позвояет получать устойчивость к ампициллину и к другим антибиотикам типа / -лактама). Кроме того, эта плазмида несет гены IEU2 и URA3 дрожжей, которые экспрессируются в штаммах E.coli и Saccharomyces erevisiae.
Плазмиду pTG 881 конструируют следующим образом.
Исходная плазмида представляет собой pTG 848, она образована из следующих рагментов ДНК:
1) Фрагмент EcoRI-Hindlll приблизиельно 3,3 кб, происходит из плазмиды pID B207. Сайт Hind III соответствует поожению 105 плазмиды 2и формы В), сайт EcoRI - положению 2243. В этом фрагменте находится ген iEU2, включенный Pstl сайт рагмента 2/г формы Р.
2)Фрагмент Hindll гена URA3.
3)Большой фрагмент EcoRI (положение 0)- Sail (положение 650) pBR 322 В сайт Pvu If этого фрагмента встраивают фрагмент
5 EcoRI-Hlndlll (концы которого предварительно затупляют в присутствии фрагмента Кленова и 4 нуклеотидов) и 510 пар оснований, соответствующих концу гона PGK. Затупленный EcoRI конец гена PGK.
10 соединенный с концом Pvu II pBR 322, восстанавливает сайт EcoRI.
4)Фрагмент Hindlll-Sal i (2,15 кв) гена PGK.
Плазмиду pTG 848 обрабатывают с по- 15 мощью Hindil и концы выделенных таким путем двух фрагментов затупляют с помощью фрагмента Кленова и 4 дезоксирибо- нуклеотидов. Два фрагмента сшивают и перед трансформацией подвергают эту
0 сшитую смесь действию Hindlll. Трансформируют штамм E.coli BJ5183 (pyrF) и транс- форманты отбирают по устойчивости к ампициллину и по пир-характеру. Таким путем получают плазмиду pTG874. где два сай5 та Hindlll удалены.
Плазмиду pTG874 гидролизуют с помощью Smat и Sail, фрагмент 8,6 кб выделяют затем из геля агарозы. Плазмиду pTG864, которая включает EcoRI-Sall (приблизитель0 но 1,4 кб) гена MFLI, клонированного в тех же сайтах pBR322, обрабатывают с помощью EcoRI. Затупленные концы плазмиды обрабатывают с помощью фрагмента Кле.нова в присутствии 4 .нук5 леотидов. Гидролиз осуществляют ферментом Sail и выделяют фрагмент EcoRI-Sall, соответствующий гену MFLI. Этот последний фрагмент лигируют с участком Smal-Sail (8,6 кб) pTG874. чтобы пол0 учить таким путем плазмиду pTG786.
Чтобы исключить сайт BglH. смежный с последовательностью промотора MFLI, осуществляют частичный гидролиз с помощью Bglll плазмиды pTG876 с последующей об5 работкой фрагментом Кленова в присутствии дезоксирибонуклеотидов. Получают новую плазмиду pTG881.
Поскольку слияние с сайтом Hindll чужеродной кодирующей ДНК позволяет осу0 ществить трансляцию в той же фазе считывания, полученный гибридный протеин включает части пре-про-гг-феромона.
Клонирование в pTG881 фрагмента HlndlH-EcoRI, который несет ген гирудина,
5 приводит к плазмиде pTG886. При осуществлении однократного клонирования сайт Bglll оказывается в нижней части фрагмента, что позволяет выделять фрагменты в форме Htnfl-Bglll, причем сайт Hinfl такой же, как сайт, используемый выше Поскольку Bglll является единственным в PTG881, то очень легко воспроизвести конец 5 кодирующей последовательности гирудина, используя 3 олигонуклеотида, кодирующих последовательность 5 гирудина и обеспечивающих считывание последовательности пре-про- а-феромона, сопровождаемой последовательностью зрелого гирудина.
Эта новая плазмида называется pTG897.
Пример 3. ДНК pTG897 служит для трансформации дрожжей TGYIsp4 (MatL, ига 3-251-373-328, his-11-15) в ura+.
Трансформированную колонию реплицируют и используют для посева не менее 10 мл питательной среды и 0,5% казамино- кислот. После 20 ч культивирования клетки подвергают центрифугированию, надоса- дочную часть подвергают диализу дистиллирован ной водой и концентрируют выпариванием (центрифу ироеание в вакууме).
Параллельно обрабатывают таким же образом культуру PGYIsp4, трансформированную pTG886, и культуру TGYIsp4, трансформированную плазмидой не несущей последовательность гирудина (TGYIsp4 PTG856). Сухие остатки поглощают 50 мкл воды и 20 мкл кипятят в присутствии 2,8% SDS и 100 ммоль меркаптозтанола, затем помещают на гель акриламида - SDS (15% акриламида; 0,1% SDS). После фиксации и окрашивания синим Coomassie обнаруживают полипептиды, которые накапливаются в держащихся на поверхности ю/льтурах TGYIsp4/pTG886 MTGYIsp4/pTG8a 7 и которые отсутствуют в контрольной культуре. Кроме того, эти ряды дополнительных пептидов мечены цистеином 3SS, как это следовало ожидать для пептидов гирудина, поскольку эта молекула очень богата цистеином.
Электрофорез осуществляют следующим образом.
Экстракты готовят следующим образом: 10 мл среды (минимально) (Yeast nitrogen Base Difco без аминокислоты 6,7 г/л, глюкозы 10 г/л, к которой добавляют 0,5% казаминокислоты), засевают различными штаммами и культивируют в течение 20 ч (стационарная фаза). Клетки центрифугируют, надосадочную часть подвергают ди- ализу относительно воды (минимум удержания: М.В. 1000), сушат центрифугированием в вакууме. Затем образцы помещают в 50 мкл буферного раствора, из которых 20 мкл обрабатывают, как описано выше, и помещают на гель акриламид - SDS (15% акриламида, 0,1% SDS).
Используют следующие штаммы:
, трансформированный плазмидой, не содержащей последовательности гирудина (контрольные),
, трансформированный pTG886,
TGYIsp4, трансформированный PTG897,
помещают маркировочные эталоны сверху вниз: 94 000, 67 000, 43 000, 30 000, 20 100, 0 14000.
Полосы обнаруживают окрашиванием в голубой цвет Coomassie R-250.
Экстракты готовят следующим образам. 100 мл минимальной среды + гистидин 40 5 мкг/мл засевают различными штаммами для культивирования в течение ночи. Когда плотность клеток достигается приблизительно 5-Ю6 (экспоненциальная фаза роста), к каждой культуре добавляют 40 мкл цисте- 0 ина 3°S (9,8 мКи/мл; 1015 Ки/ммоль). Через 10 мин клетки центрифугируют, помещают в Шмл полной среды (30°С)и инкубируют при 30°С при перемешивании. Через 3 ч 10 мл всплывающей над поверхностью части под- 5 вергают диализу водой и концентрируют до объема 0,5 мл. Приблизительно 35 000 срт (40 мкл) помещают на гель-акриламид-SDS (15% акриламида, 0,1 % SDS). Полосы протеинов обнаруживают после флюорографии. 0 Используют штаммы:
TGYIsp4, трансформированный плазмидой, не содержащей последовательности гирудина,
TGYIsp4, трансформированный 5 pTG886,
TGYIsp4, трансформированный pTG897,
Помещают маркировочные средства, молекулярный вес которых указан (хЮ3). 0 Надосадочные слои, содержащие эти полипептиды, испытывают на их антитром- биновую активность, не обнаруживают ни- какой активности.
В случае полипептида, полученного с 5 помощью TGY sp4/pTC886, оказывается, что он подвергнется нормальным стадиям расщепления предшественника а-феромо- на, что дает удлиненную молекулу гирудина с 8 аминокислотами на его конце NH2. Сле- 0 довательно, не удивительно, что полипептид, выделенный клетками TCYIsp4 pTG887, не активен.
Напротив, в случае полипептида, полученного с помощью TGY sp4/pTG897, ока- 5 зывается, что полипептид идентичен природному протеину, следовательно, активен. Несколько гипотез могут объяснить отсутствие активности:
1) Созревание протеина неполное, мо- гут остаться остатки Clu-Ala в NH2.
2)Протеин неактивен, так как он имеет не ту конформацию или же в находящемся на поверхности слое культуры имеются протеины или молекулы с молекулярным слоем
1 000, которые тормозят активность.
3)Протеин неполный, так как он был подвергнут внутриклеточному и/или внеклеточному протеолизу.
Пример 4. Если причина отсутствия активности связана с присутствием допол- нительных аминокислот с МН2 конца, то можно активизировать, подвергая пептид, выделенный TGYIsp4/pTG886, расщеплению цианбромидом. Этот реактив высоко специфичен к остаткам мегионина, и сши- тый протеин, кодированный с помощью pTG887, содержит только один метионин. Эту реакцию осуществляют следующим образом: дрожжи, содержащие плазмиду pTG886 либо контрольную плазмиду, не со- держащие включения гирудина, культивируют в 10 мл среды в течение 24 ч. К этому моменту культура достигает плотности от 7 до 1010 клеток-мл Находящуюся на поверхности часть отделяют от клеток, под- вергают интенсивному диализу дистиллированной водой, затем подвергают сублимационной сушке. Сухой порошок растворяют в 1 мл 70%-ной муравьиной кислоты и аликвотную часть используют для определения содержания всех протеинов (методом окрашивания в голубой цвет Coomassie, с реактивами), остальную часть препарата обрабатывают 1 мл свежего раствора цианбромида с 30 мг/л в 70%-ной муравьиной кислоте.
После удаления кислорода продувкой азотом пробирки инкубируют о темноте в течение 4 ч при комнатной температуре. Все практические работы в присутствии циэнб- ромида осуществляют с соответствующими предосторожностями и в вентилируемом вытяжном шкафу. Реакцию расщепления цианбромидом прекращают добавлением 10 объемов дистиллированной воды, затем раствор подвергают сублимационной сушке, .
Расщепленные пептиды снова растворяют в 10 мл дистиллированной воды и подвергают повторной сублимационной сушке два раза. Затем пептиды растворяют в небольшом объеме дистиллированной воды и аликвотную часть используют для измерения антитромбиновой активности. Остальную часть образца подвергают сублимационной сушке и двум стадиям ре- натурации описанной ниже.
Так как активность гирудина зависит от присутствия дисульфидных мостиков в молекуле, кажется вероятным, что пептид, расщепленный циэнбромидом, должен быть подвергнут ренатурации, чтобы иметь биологическую активность. Следовательно, расщепленные пептиды подвергают денатурированию в 5 М CuHCI с последующей ре- натурацией.
Подвергнутые сублимационной сушке пептиды растворяют в 400 мкл 5 М гуани- дингидрохлорида (CuHCI) в трис-НС 250 ммоль, рН 9,0; затем готовят раствор 2 ммоль восстановленного глютатиона и 0,2 ммоль окисленного глютатиона, доводя объем до 2,0 мл (конечная концентрация 1,0 М СиНС и 50 ммольтрис).
Через 16 ч инкубирования при 23°С в темноте образцы подвергают диализу в течение 24 ч три раза относительно 2 л трис- НС 50 ммоль, рН 7,5, NaCI 50 ммоль, при 23°С и конечный диализат осветляют центрифугированием
Потом измеряют антитромбиновую активность находящихся на поверхности частей. Результат этого опыта, представленный в табл.1, ясно показывает получение антитромбиновой активности в находящихся на поверхности клетках, трансформированных плазмидой pTG886
В итоге, клетки дрожжей, несущие ре- комбинантную плазмиду, экспрессируют пептид имеющий биологическую активность гирудина, после реакции расщепле ния и ренатурации. Это доказывает, что присутствие дополнительных аминокислот с NH2 конца достаточно для объяснения отсутствия активности полипептидов, имеющихся в культурах TGYIsp4/pTG886 и оно может быть также в случае культур TGYIsp4/pTG896 (хвосты G u-Ala)
Пример 5. При использовании конструкции pTG897 сохраняется опасность, что выделенный пептид сохраняет ч восты Glu- Ala в NH2, что объясняет отсутствие антитромбиновой активности этого материала. Если эта гипотеза соответствует действительности, должна быть возможность восстановления активности непосредственно в поверхностном слое с образованием участка обрыва между остатками Giu-Ala и первой аминокислотой гирудина HY-2 (изолейцин).
Это осуществляют, добавляя кодирующую последовательность для дублета hys Arg, который представляет участок узнавания эндопептидазы,вовлеченной в созревание предшественника феромона. Конструкцию получают, как описано ранее. Получающуюся плазмиду называют pTG805. Плазмида служит для трансформации штамма в ига . Вещество находящееся на поверхностном слое, анализируют гельэлектрофорезом и сравнивают с веществом, полученным с TGYIsp4/pTG897.
Использованные штаммы:
TGYlsp4, трансформированный1 PTG897;
TGYIsp4, трансформированный PTG805;
контрольный, не производящий гирудина.
Специфические полипептиды штамма TGYIsp4/pTG805 мигрируют более медленно, чем специфические полипептиды штамма TGYIsp4/pTG897. Этот результат подсказывает, что новый участок расщепле-. ния не эффективно используется эндопеп- тидазой. Тем не менее, небольшая часть полученного в результате вещества активна в противоположность тому, что получают с культурами TGYIsp4/pTG897.
2б-л
Антитромбиновая активн щихся на поверхности культу мл) приведена в табл.2.
Пример 6. При использ
рукции (pTG897) получают то шую активность гирудина потому, что второй участок предназначенный для выдел
, 0 гирудина, мало эффективен. С конструкцию, предназначенн чтобы сделать этот дополните расщепления более чувствите пептидазе, добавляя к нему в довательность 3 аминокислот которая присутствует выше hy
Используют метод, описа исключением того, что относ нуклеотидам, последовательн
-0 приведены ниже:
154
15
5-u л&ттмА
ША№ТМТТТ& ГАА- &$ ШТв-ТСТМСв- Т&ТС, ТТЛАнтитромбиновая активность находящихся на поверхности культур дрожжей (10 мл) приведена в табл.2.
Пример 6. При использовании конструкции (pTG897) получают только небольшую активность гирудина, очевидно, потому, что второй участок расщепления, предназначенный для выделения зрелого
гирудина, мало эффективен. Создают новую конструкцию, предназначенную для того, чтобы сделать этот дополнительный участок расщепления более чувствительным к эндо- пептидазе, добавляя к нему впереди последовательность 3 аминокислот Ser-heu-Asp. которая присутствует выше hys-Arg.
Используют метод, описанный выше, за исключением того, что относится к олиго- нуклеотидам, последовательности которых
приведены ниже:
154
Изобретение относится к генной инженерии, в частности к способу получения полипептида со свойствами гирудина и к штаммам Saccharomyces cerevisiae. экспрессиру- ющим предшественник гирудина. Сущность изобретения: способ получения полипептида со свойствами гирудина состоит в том, что конструируют рекомбинантные плаз- мидные ДНК pTG1818 или pTG886, трансформируют полученными плазмидами штамм дрожжей S,cerevisiae TGYIsp4, очищенный белок активируют обработкой 1 мл раствора цианбромида с 30 мг/мл в 70%- ной муравьиной кислоте. Получены штаммы a) Saccaromyces cerevisiae штамм TGYIsp4 (Mat L ura 3-251-383-328-hls-3-11-15), трансформированный плазмидой pTG1818, депонирован в Национальной коллекции культур микроорганизмов при Институте Пастера под № 1-441); б) S.cerevisiae штамм TGYIsp4 (Mat L ura 3-251-373-hls-3-11-15), трансформированный плазмидой pTG886, депонирован под номером 1-442. 2 с. и 1 з.п.ф-лы, 2 табл. сл с
Соответствующую плазмиду называют pTG818, и она отличается от PTG1805 только включением нуклеотидов 5 -TTC-GATAAA, соответствующих кодонам ser-heu-Asp.
Активность, определенная в надосэдоч- ной жидкости культур TGYIsp4 PTG1818, по уже описанным стандартным условиям составляет приблизительно 20 ед. на 10 мл культуры, или приблизительно в 100 раз выше активности, найденной в предыдущем примере. Следует отметить, что определение можно выполнять с 10 мкл неконцентрированной питательной среды.
Пример 7. В двух предыдущих примерах было показано, что присоединение нового участка hys-Arg непосредственно перед началом последовательности зрелого гирудина позволяет выделить активное вещество в надосадочной части. Однако в этих примерах, если обрыв предшественника осуществляется в первом участке hys-Arg (отдаленном от центра по отношению к началу последовательности зрелого гирудина), можно получать в питательной среде более тяжелую неактивную примесь, соответствующую цепям гирудина, удлиненным на МНз-конце. Это особенно ясно в случае культур TGYIsp4 pTG1805, где неактивная примесь составляет большинство. Это относится также к культурам TGYIsp4 pTG1818, где неактивная примесь не составляет боль
40-.й, .
шинство, но может присутствовать. Чтобы избежать потери выхода в случае синтеза неактивного вещества, дают новую конструкцию, приводящую к синтезу предшест- венника, который отличается от предшественника, синтезированного клетками TGYIsp4 pTG897, только отсутствием последовательности Glu Ala Glu Ala между участками обрыва hys-Arg и первой амино- кислотной зрелой последовательности гирудина.
Формула изобретен и я
cerevlslae CNCMY-441, экспрессирующий предшественник гирудина,
13177495014
Таблица 1 Антитромбиновая активность в находящихся на поверхности культурах дрожжей
Таблиц а 2
| Печь для непрерывного получения сернистого натрия | 1921 |
|
SU1A1 |
| Запальная свеча для двигателей | 1924 |
|
SU1967A1 |
| Physlol Chem, 348, рр.1381-1388. | |||
