Способ определения повреждений ДНК в растениях Советский патент 1991 года по МПК G01N33/50 C12N15/01 

Изобретение относится к радиобиологии и цитогенетике, а именно к способам определения повреждений ДНК в индивидуальных растительных клетках, и может быть использовано для выяснения механизма действия различных агентов на хромосомный аппарат растительной клетки, в частности для измерения необходимого количества повреждений ДНК для образования хромосомных аберраций в индивидуальной клетке, а также для определения нарушений в индивидуальной клетке при культивировании растительных тканей и для контроля состояния ДНК в клеточном ядре при СЪздании новых кариотипов в генной инженерии.

Целью изобретения является упрощение способа выявления повреждений ДНК з растительных клетках.

На фиг. 1 представлено распределение значений степени кислотной денатурации ДНК - od в популяциях индивидуальных клеток от дозы лvчeлoгo воздействия; на АН г. 2 - -раАчк чавиги- мости средней для популяции величины («бот дозы облучения, на Лиг. 3 - график зависимости ДоЈ(разность значений меяду величиной (ч в облученных и не- облученных клетках) от дозы облучения; на фиг. 4 - график зависимости степени повреждения ДНК времени репарации повреждений

Таким образом, разница в степени кислотной денатурации ДНК -Л«Јв индивидуальных растительных клетках, подвергнутых мутагенному воздействию, и контрольных (неподвергнутых мутагенному воздействию) действительно характеризует степень повреждения ЛНК и служит мерой повреждения ЛНК.

Пример 1. Опредеченне повреждений НК в индивидуальных клегклх

о оо оо

о

Vicia faha Пп situ), подвергнутых действию У --облучения.

Эксперименты проводят на меристе- матнческих кпетках первичного корня ,- Vicia faba cv Inovec.

Одинаковые по величине семена за- мачиряют в проточной воде в течение 6-7 ч. Затем помещают их во влажный песок и содержат в термостате при ю 21 С. Первичные корешки отбирают на 4-5 день после проращивания при стандартной длине 5-7 см. Облучение корешков проводят от источника По при мощности доты 0,726 Гр/мин в до- 15 зах 10, 15 и 20 Гр. Непосредственно после облучения верхушки корней обрезают и Ликсируют в этанол-уксусном Фиксаторе (3:1) в течение 24 ч, В дальнейшем корешки подвергают гидро- 20 .лизу в 1 N НС1 при 60 С в течение 11 мин, затем готовят давленные через покровные стекла в 45%-ной уксусной кислоте цитологические препараты. Покровные стекла удаляют при помощи 25 сухого льда. Высушенные цитологические препараты проводят через ряд спиртов уменьшающейся концентрации (96, 70, 50 и 30%) и нитратный буфер (рН 4,3). Затем препараты окрашивают в 30 течение 15 мин в акридин оранже (7 -10 ), приготовленном на том же цитратном буфере, и отмывают в цит- ратном буфере 3 раза по 5 мин.

изменяется от 0,13 до , а при дозе 10, 15 и 20 Гр - от О,16 до 0,53, от 0,27 до 0,57 и от 0,35 до 0,76 соответственно.

Результаты проведенных измерений показывают, что наблюдаемые при воз действии радиации смещения интервалов значений в индивидуальных клетка выявленные при кислотной денатураци ЛНК, характеризуют степень индуци- рованного облучением повреждения ДН

Затем определяют среднее значени рб для каждой дозы по результатам измерения в индивидуальных кпетках Глл этого проводят измерение значен Об не менее, чем в 200 кпртках в 3-4 повторных опытах. Средние значения Ј для каждой группы облученных при ра ных дозах клеток представлены на фиг 2

Как видно из фиг. , значение в облученных образцах растет линейно дозы. Затем по разности для облучен ных и необлученных клеток определяю степень радиационного повреждения ДНК -&,Ј

Среднее чнгг енне У- в необпученн клетках было равно 0,24-М),04, а в о лученных в дочо 20 Гр кчетках - 0,0 +0,08. Отсюда Доб для дочы 20 Гр (т. степень радиационного повреждения ДИК при -этой дозе) равняется О, 36+0,04 Диалогичным образом определяют при

При помощи микроспектрофлюориметра , лопах Ю и 15 Гр, Среднее значение исследуют люминесцгнцию однонитевых Oi для ттпх доз составляет 0,35 + 0,05 (IЈ,OH/U - красное свечение) и двуните- О вьгх (1520км зеленое свечение) участков ДИК и определяют отношение

.45+0,06,

1 степень радиационног повреждения ДНК (N0u - 0,11+0,01 и 0,,02 соответственно. Зависимость i, от дозы облучения представ лена на фиг 3 и имеет линейный ха рактер .

tf

Т6Ю +

610

характеризующее степень денатурации ДНК в контрольных и опытных образцах.

Таким образом, кислотная денатурация ДИК действительно позволяет выяРаспределение значении степени кис-45 ить ртнпцу между неповрежденной ДНК

лотной денатурации ДНК - оЈ в популяциях индивидуальных клеток контрольного и обпучрнных в дозе 10, 15 и 20 Гр образцов представлено на фиг 1 .

Как видно из фиг. 1, значения &Ь широко варьируют в индивидуальных клетках как в контрольных (кривая 1), так и в облученных образцах (кривые 2-4), Однако в клетках, подвергнутых облучению, интервал значении Об существенно отличается от интервала ,значений контрольных образцов я зависит от дозы облучения. Так, интервал значений ъб я кснтрольных клетках

50

35

в интактш-rx клетках и ДНК, поврежденной облучением

Пример 2. Определение репарации повреждений ДНК в летках Vicia faba в разные сроки после облучения.

Для определения репарации повреждений ДНК пропорпснные как п примере 1 корешки V. faha облучают в дозе 20 Гр при температуре тающего льца. Часть коротко фиксируют сразу после облучения, а другую часть помещают в ВОДУ при 20 Г и Фикгпруют через 15, 30 и 60 мин поело оОпучонил При этом КИСЛОТНУЮ денатурацию ДНК, последующее

изменяется от 0,13 до , а при дозе 10, 15 и 20 Гр - от О,16 до 0,53, от 0,27 до 0,57 и от 0,35 до 0,76 соответственно.

Результаты проведенных измерений показывают, что наблюдаемые при воздействии радиации смещения интервалов значений в индивидуальных клетках, выявленные при кислотной денатурации ЛНК, характеризуют степень индуци- рованного облучением повреждения ДНК.

Затем определяют среднее значение рб для каждой дозы по результатам измерения в индивидуальных кпетках Глл этого проводят измерение значений Об не менее, чем в 200 кпртках в 3-4 повторных опытах. Средние значения Ј, для каждой группы облученных при разных дозах клеток представлены на фиг 2

Как видно из фиг. , значение в облученных образцах растет линейно от дозы. Затем по разности для облученных и необлученных клеток определяют степень радиационного повреждения ДНК -&,Ј

Среднее чнгг енне У- в необпученных клетках было равно 0,24-М),04, а в облученных в дочо 20 Гр кчетках - 0,06+ +0,08. Отсюда Доб для дочы 20 Гр (т.е. степень радиационного повреждения ДИК при -этой дозе) равняется О, 36+0,04 „ Диалогичным образом определяют при

лопах Ю и 15 Гр, Среднее значение Oi для ттпх доз составляет 0,35 + 0,05 О

.45+0,06,

1 степень радиационного повреждения ДНК (N0u - 0,11+0,01 и 0,,02 соответственно. Зависимость i, от дозы облучения представлена на фиг 3 и имеет линейный характер .

Таким образом, кислотная денатурация ДИК действительно позволяет ртнпцу между неповрежденной ДНК

в интактш-rx клетках и ДНК, поврежденной облучением

Пример 2. Определение репарации повреждений ДНК в летках Vicia faba в разные сроки после облучения.

Для определения репарации повреждений ДНК пропорпснные как п примере 1 корешки V. faha облучают в дозе 20 Гр при температуре тающего льца. Часть коротко фиксируют сразу после облучения, а другую часть помещают в ВОДУ при 20 Г и Фикгпруют через 15, 30 и 60 мин поело оОпучонил При этом КИСЛОТНУЮ денатурацию ДНК, последующее

ir KiO6

ТГ.1 I d.il i l. ; ,-iV П С П О | V : . , I . П Г -. io;i,--:v-.-i-ir-i

. П ii. ii rj;3(i(f 7П П( ; , Г I- .Ч П П ; г; (iiipcviv icM fr TrnF Mi- лг:: .; и nf ГН К (V, I гпт--:;| г,- : r.s «Я мк х пр мч-длт ,, Пм;- : pi :; ;;. . ч . .г ;-...:.- ... : рс - ; , v- 1 - оттиглнг с причин 1.(. pc;tС1 -т.МГ : ; : . ( Л ЧОП H(1ofo УЧТИ iX i- i. ТКПХ

K,-ii, .. : .--. i, ;-.: . . .-м-- 1ч яI - .P-. О, ,,;-, а п (.( -утп-щ.;-: . в до)1 Ч; : -;,-.; .;;.--, .,,;- ,;;.: Г1г. ,. .- j - С ,f (-. 4 - /, . С Ч .Ч Л f4..ГГ.ПЯ

1ч i Г ( . i г. ..;.: , ,:. i ...-., i :), ; ; .. : ; ; } .i п . (С Н :- } : :1 :Г. И ЯО -

l ,-i|. т:,- i,,,.i . ;::: : .- . i;; - - i1 I i1-.1 1 : Р i i-.-.ii -:,.(L )

;,- :; -, ,, ;,,. -;i..-P--:I H.- я -ч ; || |, - , Xv-.--.- :i.n сстюc- rnv. ;-i i ; -: i ; : ч-: ini :i, ; .;г. -н и H: :;н на . , Г . :г;. .)-;,,,,,,. .,..; V ,; . .1 Л . Ь , 1 I : Т ; i J. V Г Т

, 11 i ;, ;. i ..,:. -,-; , f L П1. Pt Л ...ч l : МСТОДЯ т,-и (ii.;, i. ;м-;-е, 1.т-..-:ч нпп ::;i :.;.:.- ;( :: р:: т :;-т

;: . , ,, - . , i i

; ..:-.. .. .:;,-, /С г :-i .ч .; : ч ( - р е : р f IT я

: . i|:p , - . ,F: ; ;i.C(MH

M. il i . ,v: ., i i 1C щ ч Г) -

;i ;,- ,-1. -; г , г г- :-Г vi:rv- , г;;,,i,--v..-, ( т-.с.г;; -1 т -- P-ii T Mii: ;|;;оржн г-;; ; - Т .: . г : -.4 U M f lifb; Ti ipO, ..ii-.. г1 ; ii: ;rfr . :-.Т1 пму гч /i ;) v иг |f,:-nj:.;,., . IHili ТГ П ИПЛИНИ,-. :i :-:.:.: к:-,- ; : г1/: ГУЛЯТ Ч;- .v КОИРНИИ

Изобретение относится к радиобиологии и цитогенртике и касается определения повреждений ДНК в индивидуальных растительных клетках. Целью изобретения является упрощение способа определения повреждений ДНК в растениях. Способ заключается в том, что проростки растения выдерживают в этанол-уксусном фиксаторе, осуществляют кислотный гидролиз, а о наличии повреждений ДНК в индивидуальных клетках судят на основании результатов спектроАотометрического анализа. 4.ил.

Ч

:, Л

/ . .-- .

.-х- -

(J- « ч.. -. ri f( -. .л

е о ,.

с х

х

с

7т

vo

«5s

Ч

Ра

СГл

с

l

X

1

Сл

о,Р l ,6 ил

0,2

О

ЛИГ.4

15

3045

60

МИН