Ингибитор репарации двунитевых разрывов ДНК Советский патент 1988 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к экспериментальной генетике, преимущественно к изучению генетически активных химических соединений, и может быть исполь- зовано при исследовании характера пов реждаю1цих воздействий ряда мутагенных факторов окружающей среды, а также к онкологии для усиления действия ионизирующего излучения при радиотерапии опухолей.

Основу изобретения составляет выявленное новое свойство кисльрс о -поли- пептидов (полиглутамата и полиаспар- тилглутамата), которые ранее исполь- зовались для подавления репарации од- нонитевых разрывов ДНК, полностью ин- гибировать восстановление двунитевых разрывов (ДР), возникающих в ДНК под действием v-облучения,

В качестве модельной системы при исследовании эффекта полиглутамата - (ПГ) и полиаспартилглутамата (ПАГ) используют находящиеся в логарифмической фазе роста несинхронизирован- ные культуры клеток Hela и фиброблас- тов китайского хомячка, которые подвергают воздействию -облучения (в дозе 50-100 Гр) в присутствии ингибиторов.

Вывод о полном (в пределах ошибки измерения) подавлении процесса восстановления ДР в период контакта ингибиторов с клетками (как в ходе облучения, так и после его окончания) делается на основании данных о примерном равенстве степеней деградации ДНК в опытных образцах и контроле, - где репарация заблокирована охлаждением до , а также на основании данных о сохранении в присутствии ПАГ и ПГ, достигнутого в результате облучения уровня деградации, ДНК в течение длительного времени (1 ч). При этом принимается во внимание, что в i период контакта ингибиторов с клетками уровень включения Н-тимидина составил не более 3% от контрольного,

Присутствие в среде инкубации ПГ и ПАГ (в концентрациях, достаточных для полного подавления репарации) саМО по себе не вызывает образования ДР и практически не сказывается на жизнеспособности клеток. Действие t обоих ингибиторов носит обратимый ха- рактер.

Полное ингибирование процесса восстановления ДР под действием ИГ и ПАГ наблюдается при концентрациях, в нес

Q

5 0

5 0

.-. j.

5

колько раз менылих, чем в известном ингибиторе (20 мкМ для ИГ и 100 мкМ для ПАГ ггротив 400 мкМ в случае 9-уз- -арабинофураиозиладенина); время обработки клеток предлагаемыми ингибиторами, необходимое для получения максимального эффекта, в 2-4 раза меньше, чем при использовании известного ингибитора (10-15 мин против 30- 60 мин) ,

Кроме того, ИГ и ПАГ не проявляют избирательной токсичности по отношению к клеткам, находящимся в S-фазе клеточного цикла, и, следовательно, работа с ними не требует синхронизации клеточных культур и перевода их в стационарную фазу роста.

Пример 1. Ингибирование репарации двунитевых разрывов ДНК в клетках Hela, облученных в дозе 100 Гр, полиаспартилглу гаматсм. Использовали несинхронизованнуга, находящуюся в логарифмической стадии роста, моно- слойную культуру двуднев щх клеток Hela, которые культивировали на среде 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота. Сразу .после посева клеток в среду вводили Н-ти- мидин (0,5 мкмК/мп), за 16 ч до начала эксперимента среду с меченым тими- дином сливали, клетки промьшали средой 199 и инкубировали в среде с сы-, вороткой. В эксперименте использовали два образца клеток.

Первый образец. Клетки, облучаемые при в присутствии ингибитора восстановления, промывали физраст вором рН 5,0, добавляли полиаспартил- глутамат (о1 -поли-ВЬ-аспартилглутамат, статистический полипептид с мол.мае, 1,5-3,5 тыс. дальтон) в концентрации 10 мкМ в физрастворе с рН 5,0,

Через 10 мин после добавле 1ия ингибитора клетки облучали в дозе 100 Гр при мощности дозы 3,3 Гр/мин и через. 10 мин после окончания облучения в части клеток определяли степень деградации ДНК, Другую часть клеток отмы- вали средой 199 от ингибитора и культивировали на среде с сывороткой при в течение 4ч, Через 1, 2, 3 и 4 ч определяли степень деградации ДНК.

Второй образец. Клетки, облучаемые при 4°С, промывали физраствором с рН 5,0 и температурой 4°С, облучали в физрастворе в той же дозе при 4 С и через 10 мин пбсле окончания облучё10

20

Условия обработки

пня в части клеток определял степень деградации ДНК. Другую часть клеток отмывали средой 199 и культивировали на среде с сывороткой при в течение 4 ч. Через 1, 2, 3 и 4 ч определяли степень деградации ДНК.

Степень деградации ДНК во всех случаях измеряли методом элгации с мем- браньгых фильтров в не денатурирующих условиях с последуюц им определением радиоактивности в толуольно-тритоно- вом сцинтилляторе.

ДНК, оставшаяся на фильтре, составляет, %: для клеток, облученных в при-, сутствии полиаспартилглутамата, при фиксации сразу после облучения 17,2± t5,6, зафиксированных через 1, 2, 3 и 4 ч репарации 45,91:3,0; 50,4 + 4,2; 54,,2; 65,013,0 соответственно; для клеток, облученных hpH 4°С и зафиксированных сразу после облучения 21,5t3,0, зафиксированных через 1, 2, 3, 4 4} репарации соответственно 64,,8; 72,813,8; 84,111,9.и 86,0t 25 клеток 5,6.

Пример 2. Ингибирование репарации двунитевых разрывов ДНК в фибро- бластах китайского хомячка клона 431, облученных в дозе 100 Гр, полиглута- матом.

Методика выращивания клеток, обработки ингибитором восстановления, облучения, отмывки и репарации разрывов, определения степени деградации ДНК аналогична описанной в примере 1, При этом концентрация полиглутамата (о(-поли-о -глутаминовая .кислота с МО л. мае. 2-15 тыс. дальтон) составляла 20 мкМ/л.

ДНК, оставшаяся на фильтре, состав ляет, %: для клеток, облученных в присутствии ингибитора и зафиксированных сразу после облучения, 21,It7,4, .зафиксированных после от полиглутамата и репарации в течение 1, 2, 3,4 52,915,1; Ы,2±f,G, 57,,7 соответственно, для клеток, облученных при 4 с и зафиксированных сразу после облучения, 24,0t5,5, зафиксированных через 1, 2, 3 ч репарации соответственно 81,510,2; 76,9±2,8 и 79,7t1,7:

Пример 3. Использовали клетки китайского хомячка клона 431. Пекоицентрациях. Затем вводили тимидин облучали клетки (в дозе 70 Гр) и определяли уровень включения метк1. Часть образцов отмывали от ингибиторов, затем продолжали инк убировать н среде с сывороткой - Н-тим1щином в те чение 2ч.

В таблице приведены результаты из мерений. За 100% принималось включе-. ние в клетки, инкубйруем111е без ингибиторов и соответствовало 207181 15510 имп/мин/млн.клеток. Число опытов, из которых представлены ниже 5; средние значения, составило 3-4. В таблице приведен уровень включения для нерастворимой в ТХУ фракции (уровень включения кислотораствори- мой фракции меченого тимпдина близок для всех вариантов опыта).

Уровень включения после облучения в присутствии ингибиторов

30

З ровень включения через 2 ч после отмывки клеток от ингибиторов

35

Без ингибитора

Ингибитор ПА Г

Ингибитор ПГ

100

1,4+0,6

2,911,5

578,5t187,6

62,1119,4

83,2t18,5

40

45

Из приведенных примеров ясно, что полиглутамат (мол.мае. 2-15 тыс. даль тон) и полиаспартилглутамат (мол.мае. 1,5-3,5 тыс. дальтон) в соответствующих концентрациях обеспечивают полное Ингибирование процесса репарации ДЕ и обладают большей относительной эффективностью и меньшей токсичностью

Формула изобретения

Применение с/-поли-Ь-аспартилглута- мата с мол.мае. 1,5-3,5 КД или о -поред введением Н-тш-шдина клетки ин-г ли-Ъ-глутаминовой кислоты с мол.мае. кубировали в течение 15 мин с инги- 2,0-1,5 КД в качестве ингибитора ре- биторами в указаннь1х в примерах 1 и 2 парации двунитевых разрывов ДНК.

коицентрациях. Затем вводили тимидин, облучали клетки (в дозе 70 Гр) и определяли уровень включения метк1. Часть образцов отмывали от ингибиторов, затем продолжали инк убировать на среде с сывороткой - Н-тим1щином в те-, чение 2ч.

клеток

В таблице приведены результаты измерений. За 100% принималось включе-. ние в клетки, инкубйруем111е без ингибиторов и соответствовало 207181 15510 имп/мин/млн.клеток. Число опытов, из которых представлены ниже средние значения, составило 3-4. В таблице приведен уровень включения для нерастворимой в ТХУ фракции (уровень включения кислотораствори- мой фракции меченого тимпдина близок ля всех вариантов опыта).

об

Уровень включения после облучения в присутствии ингибиторов

З ровень включения через 2 ч после отмывки клеток от ингибиторов

30

5

Без ингибитора

Ингибитор ПА Г

Ингибитор ПГ

100

1,4+0,6

2,911,5

578,5t187,6

62,1119,4

83,2t18,5

,

40

5

Из приведенных примеров ясно, что полиглутамат (мол.мае. 2-15 тыс. даль- тон) и полиаспартилглутамат (мол.мае. 1,5-3,5 тыс. дальтон) в соответствующих концентрациях обеспечивают полное Ингибирование процесса репарации ДЕ и обладают большей относительной эффективностью и меньшей токсичностью.

Формула изобретения

Применение с/-поли-Ь-аспартилглута- мата с мол.мае. 1,5-3,5 КД или о -поли-Ъ-глутаминовой кислоты с мол.мае. 2,0-1,5 КД в качестве ингибитора ре- парации двунитевых разрывов ДНК.

Изобретение относится к экспериментальной генетике, преимущественно к исследованиям генетически активных химических соединений, и может быть использовано при изучении характера действия ряда мутагенных факторов окружающей среды, а также в онкологии для усиления действия ионизирующего излучения при радиотерапии опухолей. Основу изобретения составляет выявленное авторами новое свойство.кислых (/-полипептидов (полиглутама та и полиаспартилглутамата), ранее использовавшихся в качестве ингибиторов репарации однонитевых разрывов ДНК, полностью подавлять восстановление двунитевых разрывов, которые возникаг ют в ДНК под действием облучения. Вывод о полном (в пределах ошибки измерения) подавлении:процесса репарации ДР в период контакта клеток (Hela и фибробластов китайского хомячка) с ингибиторами (как в ходе облучения, так и после его завершения) может быть сделан на основании данных: а) о равенстве степени деградации ДНК в опытных образцах и контроле, где восстановление ДР нацело блокировано охлаждением до 4°С сразу после окончания облучения; б) о сохранении в присутствии ПГ и ПАГ достигнутого в результате облучения уровня деградации ДНК, после завершения обработки г.-лучами; в) о незначительном уровне (менее 3% от1 онтроля) включения Н-тимидина клетками в период их контакта с ингибито - рами. Предложенные ингибиторы сами по cefie не вызывают образование ДР в ДНК и практически не влияют на жизнеспособность клеток; действие обоих ингибиторов обратимо. Максимальный эффект достигается при концентрациях ПГ и ПАГ соответственно 20 и 100 мкм (против 400 мкм для прототипа - -арабйнофуранозиладенина); время, необходимое для достижения максимального эффекта 10-15 мин (против 30-60 мин для прототипа). В отличие от известных ингибиторов восстановления ДР ПГ и ПАГ не обнаруживают токсического действия по отношению к клеткам, на- ходящимся в S-фазе, и, следовательно работа с ними не требует синхронизации клеточных культур и перевода их в стационарную фазу. 1 табл. (Л 00 со 00 fC