Способ проведения точечного иммуноферментного анализа Советский патент 1991 года по МПК G01N33/535 

(Л

С

Изобретение относится к методам исследования, применяемым в биологии и медицине, в частности к проведению точечного иммуноферментного анализа (ТИФА). Цель изобретения состоит в ускорении и упрощении ТИФА. Сущность изобретения состоит в том, что твердофазный реагент в виде антител или антигена наносят на блок полимерной мембраны в виде параллельных полос, после чего мембрану либо раз- резают на полосы перпендикулярно направлению нанесения реагента и обрабатывают определяемыми образцами и имму- нореагентами в лотках или пробирках, либо разворачивают ее на 90° и обработку определяемыми образцами и иммунореагентами проводят в камере миниблоттера. Изобретение позволяет снизить затраты времени при нанесении твердофазного реагента в 3 раза, при добавлении тестируемых образцов и иммунореагентов в 2 раза, а также позволяет снизить расход реактивов в 15 раз по сравнению с прототипом. 2 табл

Изобретение относится к методам ис- . следования, применяемым в биологии и медицине, в частности к проведению точечного иммуноферментного анализа.

Целью изобретения является ускорение и упрощение способа проведения точечного иммуноферментного анализа (ТИФА).

Способ осуществляется следующим образом.

Вырезают из листа микропористой мембраны (нитроцеллюлоза, поливинилен- дихлорид, полиамиды и др.) блок таких размеров чтобы можно было нанести заданное количество антигенов (или антител) в виде полосок шириной 1 - 5 мм с расстояниями между ними не менее 2 мм. Мембранный блок можно предварительно модифицировать любым из способов для усиления сор- бционной активности или активировать для ковалентного связывания твердофазного

реагента. Выбранные для скрининга антигены (или антитела) наносят на подготовлен- ный блок одним из существующих методов, например, с помощью аппарата для аппликации образцов в тонкослойной хроматографии, с помощью автоматической пипетки или аппарата для мультиблоттин- га таким образом, чтобы получились тонкие параллельные полоски по всей длине блока. Существенно, чтобы каждый антиген (или антитело) локализовались только в своей полосе и не смешивались. Предварительно, опытным путем, определяют оптимальное количество твердофазного реагента на единицу площади полости. Отмывают несвязавшиеся компоненты буферным раствором (например, 20мМтрис-НС,500мМ №CI, рН 7,4, содержащим 0.05 - 0,1 % неионного детергента типа тритон Х-100 или нонидет Р- 40) и блокируют свободные центры

О

о

-А

ел

связывания мембраны индифферентным белком (1 - 3% бычий сывороточный альбумин, 1 - 3% желатин, 1 - 3% казеин, 5% обезжиренное молоко и др). При выявлении антител к большому количеству антигеноо (до 20 и более) способ можно проводить в нескольких вариантах.

В этом случае на каждой полоске зоны с нанесенными антигенами чередуются со свободными зонами. Инкубация с анализируемым образцом и последующее проявле- ние иммунных комплексов осуществляется отдельно в лотках для каждой пробы.

помещают в аппарат для мультиблоттинга, при этом разворачивают мембрану на 90° по отношению к направлению инкубационных каналов. Тестируемые образцы наслаивают на мембрану в виде тонких параллельных узких полос шириной 1-5 мм и расстояниями между ними не менее 2 мм. Это приводит к образованию в участках перекреста со специфическим антигеном иммунных комплексов. Последующее выявление иммунных комплексов осуществляется во всех трех вариантах по единой схеме: отмывка от иесвязавшихся компонентов, добавление антивидовых антител, меченных ферментом, повторная отмывка несвязавшихся компонентов и выявление активности фермента с помощью субстрат- хромогенной смеси.

П р и м е р 1. Определяют Ig Е-антитела к девяти аллергенам, имеющих ведущее значение в клинике аллергических заболеваний. Параллельно проводят анализ аллер- генспецифических SQ Е-антител по способу прототипа и с помощью радиоаллерго- сорбентного метода (коммерческие наборы Фадебак PACT Pharmacia, Швеция.

к Из г-; троцеллюлозной мембраны вы- резают блок размером 7,4x7,4 см и промывают дистиллированной водой Зраза по 10 мин.

2, Препараты аллергенов (экстракты по 60 мкг белка в мл) накосят с помощью автоматического дозатора для тонкослойной

хроматографии ДТХ-01 в виде тонких узких параллельных полос в следующей последовательности: 1 - домашней пыли, 2 - клеща домашней пыли Дер. птеронис, 3 - шерсти собак, 4 - шерсти кошек, 5 - гриб Альтернар, б - пыльцы березы, 7 - пыльцы амброзии, 8 - пыльцы тимофеевки,-9 - пыльцы тополя, 10 - референс-препарат аллергенов трески, охарактеризованный по компонентному составу в иммуноблоттинге. Затем оставляют полоску свободной мембраны шириной 6 мм и повторно наносят экстракты препаратов аллергенов в той же последовательности. Таким образом на одном листе мембраны получают два мембранных блока с иммобилизованными в виде тонких узких параллельных полос девятью препаратами аллергенов и одним референс-препаратом.

началом реакции смешивают свежеприготовленные растворы субстрата (6 мкл 30% перекиси водорода в 10 мл ТБС) и хромогена (6 мг 4-хлор-1-нафтола в 2 мл метанола). Полоски выдерживают в этой смеси 15 мин. Реакцию останавливают промыванием полосок дистиллированной водой.

аллергенспецифических lgE-антител выражают в трех уровнях: II класса, II класс II и класса. Отрицательным контролем реакции служили зоны мембраны, не содержащие аллергенов. Для скрининга аллергенспецифических lgE-антител такая полуколичественная оценка вполне достаточна для диагностики аллергических заболеваний. Если необходимо, результаты реакции оценивают количественно в единицах оптической плотности при помощи денситометрии.

Специфичность и чувствительность заявляемого способа оценивают по корреляции с данными PACT при тестировании 121 сыворотки, полученных от пациентов с клинически подтвержденным диагнозом. Результаты исследований представлены в табл.1.

П р и м е р 2. 1. Из листа нитроцеллю- лозной мембраны вырезают блок размером 7,4x7,4 см и промывают его дистиллированной водой 3 раза по 5 мин.

камере миниблоттера (Immuneties, США) Для этого перед установкой мембранного блока в аппарат его разворачивают на 90°. Следовательно, направление инкубационных кана,юв камеры становится перпендикулярным направлению полос сорбированных аллергенов. В каждый ка- нзл вносят 100 мкл разведенной (1:2)сы- воротки крови. Камеру покачивают на

платформе с частотой 58 качаний в 1 мин при комнатной температуре в течение 2 ч.

Проявление иммунных комплексов (стадия 9 - 11) может осуществляться и в лотках, однако в этом случае наблюдается значительный расход иммунореагентов.

Воспроизводимость, чувствительности и специфичность заявляемого способа и прототипа оценивали в комплексе с данными, полученными для PACT. Показана высокая степень совпадения случаев уровня аллергенспецифических lgE-антител (табл.1). Сравнительный анализ отличий заявляемого способа и прототипа выявил существенные преимущества (табл.2),

которые можно суммировать следующим образом:

заявляемый способ существенно снижает затраты времени на проведение анализа (при нанесении твердофазного

реагента в 3 раза, а при добавлении тестируемых образцов и иммунореагентов з 2 раза;

упрощение способа выражается в значительном уменьшении расхода реактивов

(в 15 раз) по сравнению с прототипом.

Формула изобретения Способ проведения точечного иммуно- ферментного анализа, включающий нанесе- ние антигена или антител на полимерную

мембрану с последующим добавлением исследуемого образца, инкубацией и проявлением иммунных комплексов, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, антигены и антитела наносят на блок полимерной мембраны в виде параллельных полос, далее либо

Определение уровней аллергенспецифических lgE-антител, выявленных заявляемым

способом и методом PACT

Сравнительный анализ отличий заявляемого способа и прототипа по

примеру 2

мембрану разрезают на полосы перпендикулярно направлению нанесения материала и обрабатывают реагентами в лотках или пробирках, либо разворачивают ее на 90° и обработку, исследуемым образцом проводят в камере миниблот- тера.

10

Та бл и ц а 1

Таблица2