СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ ФОРМЫ СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА СЫВОРОТКИ, СОДЕРЖАЩЕГО АЛЛЕРГЕНСПЕЦИФИЧЕСКИЙ ИММУНОГЛОБУЛИН Е (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2023 года по МПК A61K39/395 A61K9/19 A61K38/00 

Изобретение относится к областям биотехнологии и медицины. Предлагаемый способ может быть использован для получения лиофилизированной формы стандартных образцов аллергенспецифических сывороток (сывороток, содержащих специфический иммуноглобулин Е к определенному аллергену), необходимых при оценке качества препаратов аллергенов.

Препараты аллергенов относятся к группе иммунобиологических лекарственных препаратов, предназначенных для лечения и для in vivo диагностики аллергических заболеваний, обусловленных развитием аллергических реакций немедленного типа с участием иммуноглобулина E (Committee for medicinal products for human use, guideline on allergen products: production and quality issues, European Medicines Agency, London. 2008. Available from: http://www.emea.europa.eu/). Все препараты аллергенов, используемые в настоящее время в практике здравоохранения, содержат как аллергенные, так и не аллергенные компоненты, поскольку их получают из природных источников. Одним из главных показателей качества этих препаратов является оценка аллергенной (специфической) активности. До 2020 г для оценки этого показателя в препаратах аллергенов, производимых в РФ, использовались только методы in vivo (кожные пробы) (Государственная фармакопея Российской Федерации. - XIV издание. - М., 2018.). Кожные пробы проводятся на пациентах с аллергическими заболеваниями. С развитием иммунохимических методов исследования стало возможным определять аллергенную активность методами in vitro. Для этого используются разные методы иммуноанализа (ИФА, иммуноблот, РИД), основанные на ингибировании связывающей активности сывороточного иммуноглобулина E, специфичного к исследуемому аллергену (аллергоспецифических IgE антител) (European Pharmacopoeia (Ph. Eur.). - 10th Edition). Для оценки аллергенной активности отбирают сыворотки крови пациентов с подтвержденным аллергологическим заболеванием. Оценку уровня IgE антител к конкретному аллергену у них проводят с помощью коммерческих полуколичественных или количественных тест-систем. В испытания отбираются сыворотки с уровнем IgE антитела не менее 3 класса (интервал от 3,5 до 17,49 кЕ/мл; 1 кЕ соответствует 2,4 нг).

Для обеспечения единства и требуемой точности измерений аллергенной активности в методиках рекомендуется использовать стандартные образцы (СО) или референс-образцы аллергена и аллергенспецифической сыворотки (Committee for medicinal products for human use, guideline on allergen products: production and quality issues, European Medicines Agency, London. 2008. Available from: http://www.emea.europa.eu/). Международные СО аллергенспецифических сывороток в настоящий момент времени отсутствуют. Известны 5 международных референс-сывороток (изготовитель - NIBS), содержащих IgE антитела, к аллергену из грибов Aspergillus fumigatus (78/545), аллергену из пыльцы березы (76/525), из пыльцы ежи сборной (77/503), аллергенам клещей Dermatophagoides pteronyssinus (77/584), к аллергену из эпителия кошки (79/530). Их недостатком является то, что они представляют собой лиофилизаты, которые не были охарактеризованы по количественному содержанию IgE антител, их наличие подтверждено лишь качественно, и технология их производства не опубликована (NIBS. Available from: https://www.nibsc.org/products/brm_product_catalogue).

В доступной литературе информация о разработке в РФ лиофилизированных сывороток, содержащих специфические IgE антитела к определенному аллергену, отсутствует. Известно, что фармацевтические компании, выпускающие препараты аллергенов, для оценки их активности, производят образцы аллергенспецифических сывороток в жидком виде для внутреннего использования (Инструкция по применению набора реагентов "Тест-система иммуноферментная для контроля подлинности аллергенов, микст-аллергенов, аллергоидов и микс-аллергоидов" производства АО "ФГУП НПО "Микроген"; Технический паспорт "Пул сыворотки для аллергена амброзии полыннолистной для анализа методом ТАРЕ" - "АЛК-Абелло А/С", Available from: alk,net.).

Следует отметить, что в РФ имеется опыт создания лиофилизированных сывороток, содержащих иммуноглобулин G к вирусу иммунодефицита человека (патент RU 2094807 «Способ получения стандартной позитивной панели сывороток для контроля качества иммуноферментных тест-систем и иммуноблотов», опубликованный 19.10.1993), который включает приготовление иммунных сывороток, содержащих специфические IgG антитела. В описанной технологии используются сыворотки, не подвергшиеся замораживанию. Кроме того, особенностью специфических IgG антител является то, что они связываются со всеми белками как аллергенной, так и не аллергенной природы. Поскольку, для оценки активности препаратов аллергенов рекомендуется использовать специфический иммуноглобулин E, который связывается только с аллергенным компонентом, технология получения лиофилизированных сывороток по патенту RU 2094807 не подходит для получения лиофилизированной формы стандартного образца аллергенспецифической сыворотки.

Также необходимо отметить, что количество пациентов, сенсибилизированных к определенным аллергенам, кровь которых является источником сырья, может значительно варьировать. Так, например, в Московском регионе у большинства пациентов, страдающих поллинозами, выявляют повышенную чувствительность к аллергенам из пыльцы березы, тимофеевки, полыни. К другим видам пыльцевых аллергенов количество сенсибилизированных пациентов относительно невелико. В южных регионах, наоборот, пациентов с повышенной чувствительностью к пыльце березы, тимофеевки мало, чаще всего выявляются пациенты, у которых выявлена повышенная чувствительность к пыльце амброзии и клещам домашней пыли (Elisyutina O., Erina O., Fedenko E., Litovkina A., Valenta R., Lupinek C., Khaitov M. Molecular profiling of allergic sensitizations in a Moscow pediatric case-control population. - 2018 - Allergy - V. 73 - S. 105- P. 193.; Karsonova A., Rjabova K., Curin M., Villazala-Merino S., Niederberger V., Eckl-Dorna J., Fröschl R., Perkmann T., Fomina D., Beltiukov E., Glazkova P., Zhernov Yu., Elisyutina O., Fedenko E., Khaitov M., Karaulov A.,Valenta R., Campana R. Quantification of allergen-specific IgE in patients with birch and cat allergy by ELISA - Abstracts Second Moscow Molecular Allergology Meeting (ММАМ 2019). Поэтому сбор достаточного количества образцов для производства серии СО специфического иммуноглобулина Е может занять относительно большой период времени (более 6 месяцев) и, соответственно, необходимо рассмотреть возможность хранения сырья в условиях не выше -20 °С.

Из литературы известны требования, предъявляемые к источнику сырья - крови человека. Для этого забирают кровь у вышеуказанных пациентов (не более 20 мл, поскольку здоровыми донорами они не являются) и получают сыворотку крови стандартным способом (выход сыворотки - примерно 1/3 от объема цельной крови), затем формируют пул путем смешивания. Требования к хранению источника сырья регламентируются Постановлением правительства РФ от 22.062019 № 797. Жидкая сыворотка крови может храниться при + 2-8 °С до 6 мес (Committee for medicinal products for human use, guideline on allergen products: production and quality issues, European Medicines Agency, London. 2008. Available from: http://www.emea.europa.eu/; Таранов А.Г. Диагностические тест-системы. Радиоиммунный и иммуноферментный методы диагностики. - 2002 - М. - "Мокеев" - 287 с.; Требования к хранению и транспортировки донорской крови и ее компонентов. - Постановление правительства РФ от 22 июня 2019 г, № 797, Available from: https://donor.mos.ru/uslugi/dlya-lechebnyix-uchrezhdenij/trebovaniya-k-transportirovke-materiala).

В связи с вышеизложенным, а также с учетом того факта, что в РФ выпускается более 70 наименований препаратов аллергенов, актуальной практической задачей является создание простой технологии получения стандартных образцов аллергенспецифических сывороток с высоким содержанием иммуноглобулина Е и более длительным, чем 6 мес, сроком хранения и, которые будут применяться для оценки аллергенной активности, с использованием методов на основе твердофазного конкурентного ИФА (методика ИФА-ингибиция для оценки аллергенной активности ФГБУ «НЦЭСМП» МЗ РФ и методика конкурентного ИФА (кИФА) - авторы АО «НПО «Микроген») и создание банка аллергенспецифических сывороток.

Технический результат заключается в получении аллергенспецифических сывороток с высоким содержанием иммуноглобулина Е (3-4 класса), хранящихся более 6 месяцев при низких температурах с сохранением высокого уровня иммуноглобулина Е.

Технический результат достигается двумя вариантами способа получения лиофилизированной формы стандартного образца сыворотки, содержащего аллергенспецифический иммуноглобулин Е.

Первый вариант способа получения лиофилизированной формы стандартного образца сыворотки, содержащего аллергенспецифический иммуноглобулин Е включает этапы хранения сыворотки при температуре от (+8 °С до - 70 °С), стабилизации пула путем отстаивания образца сыворотки в течение 15 часов с дальнейшей фильтрацией образца сыворотки и внесением антимикробного вещества, далее образец разливают по флаконам и переходят к этапу лиофилизации путем последовательного замораживания образца сыворотки и лиофильной сушке, а именно образец сыворотки замораживают при температуре (- 70 °С) в течение 5 часов и далее лиофилизируют в лиофильной сушке аппаратного типа в течение 17 часов при остаточном давлении (0,2 - 0,08 Па).

Второй вариант способа получения лиофилизированной формы стандартного образца сыворотки, содержащего аллергенспецифический иммуноглобулин Е включает этапы хранения сыворотки при температуре от (+8 °С до - 70 °С), стабилизации пула путем отстаивания образца сыворотки в течение 15 часов с дальнейшей фильтрацией образца сыворотки и внесением антимикробного вещества, далее образцы разливают по флаконам и переходят к этапу лиофилизации путем последовательного замораживания образца сыворотки и лиофильной сушке на установке камерного типа, а именно образец сыворотки замораживают при температуре (- 40 °С) в течение 3 часов, далее создают вакуум 5 Па (температура конденсора -75 °С, температура полки 20 °С), далее поднимают температуру полки до 30 °С при 0,1 Па и досушивают до достижения температуры образцов 25-27 °С.

Пример 1. Осуществление заявленного способа (вариант 1).

Собранные от разных пациентов ранее сыворотки, содержащие специфический иммуноглобулин Е, к аллергену от пыльцы березы хранили в фармацевтическом холодильнике при температуре -70 °С. Авторы экспериментально подтвердили, что собранные от разных пациентов сыворотки, содержащие специфический иммуноглобулин Е возможно хранить при различных температурных режимах (от 8 °С до - 70 °С), при этом качество сыворотки (высокий уровень специфического иммуноглобулина Е - не ниже 3 класса) сохраняется после размораживания. Затем сыворотки размораживали 1-2 ч при комнатной температуре и объединяли в пул в стеклянном стакане.

Стакан с пулом сыворотки помещали на магнитную мешалку "Heidolph MR 3001" на 5 мин и средней скоростью перемешивания (400 rpm), заклеивали герметизирующей пленкой "Prafilm-M" и помещали в фармацевтический холодильник "Pozis" для стабилизации при температуре 2-8 °С на 15 ч. После стабилизации пул сыворотки фильтровали через 4 слоя марли медицинской и вносили в сыворотку антимикробное вещество, например, 0,01 % раствор тиомерсала из расчета 1 мл раствора тиомерсала на 10 мл пула.

После стабилизации сыворотку разливали по 1,0 мл в стеклянные флаконы общим объемом (2,0 или 3,0 мл) с помощью автоматического степпера "Labsystems". Флаконы с сывороткой устанавливали в специальные металлические сосуды для лиофилизации. После заполнения флаконами сосуды для лиофилизации помещали в низкотемпературный холодильник для замораживания при температуре -70 °С в течение 5 часов. По окончании замораживания, сосуды для лиофилизации вынимали из морозильника и подключали к лиофильной сушке коллекторного типа UsifroidMRS16. Данная лиофильная сушка состоит из вакуумного насоса и конденсора. У конденсора есть система резиновых патрубков, с помощью которых сосуды для лиофилизации подключаются к конденсору. После подключения сосудов с флаконами сывороток к конденсору, в лиофильной сушке создавали вакуум с остаточным давлением 0,08-0,2 Па, который контролировали с помощью вакуумметра (датчик Пирани ERSTEVAK MTP4D). Температуру конденсора лиофильной сушки поддерживали на уровне -70 °С с помощью смеси спирта этилового и твердой углекислоты («сухой лед»). Высушивали в течение 17 часов. По окончании высушивания, сосуды для лиофилизации отключали от сушки, из них вынимали флаконы и немедленно вручную закрывали резиновыми пробками с последующей фиксацией алюминиевыми колпачками с помощью кримпера № 13.

В таблице 1 приведены экспериментально подтверждающие получение высокого уровня иммуноглобулина Е данные, и показано, что при разных температурах замораживания сывороток крови и после лиофилизации уровень остается стабильно высоким (3-4 класс).

Таким образом, при осуществлении первого варианта способа получения лиофилизированной формы стандартного образца сыворотки, содержащего аллергеноспецифический иммуноглобулин Е наблюдается достижение технического результата, а именно получают аллергенспецифические сыворотки с высоким содержанием иммуноглобулина Е (3-4 класса). Авторами также подтверждено экспериментально (таблица 5), что в полученном заявленным способом стандартном образце при длительном хранении сохраняется высокий уровень иммуноглобулина Е.

Пример 2. Осуществление заявленного способа (вариант 2).

Собранные от разных пациентов ранее сыворотки, содержащие специфический иммуноглобулин Е, к аллергену от пыльцы тимофеевки хранили в фармацевтических холодильниках при температуре -30°С (возможно хранить при различных температурных режимах 8 °С - (- 70 °С). Затем сыворотки размораживали 1-2 ч при комнатной температуре и объединяли в пул в стеклянном стакане. Этап хранения сыворотки от разных пациентов, соединение в пул, стабилизация пула сыворотки осуществляли согласно примеру 1.

Лиофильное высушивание проводили на установке камерного типа Epsilon 2-4 LSCplus производства Martin Christ, Германия. На аппаратах данного типа все этапы лиофилизации, а также укупоривание флаконов проводили в камере устройства. Датчики температуру и электроводимости образцов позволяют контролировать состояние высушиваемых образцов, так чтобы подобрать оптимальные параметры высушивания: температуру полки, время этапа лиофилизации и глубину вакуума. Сыворотку разливали по 1,0 мл в стеклянные флаконы общим объемом (2,0 или 3,0 мл) с помощью автоматического степпера "Labsystems". В горловины флаконов вставляли резиновые пробки для лиофилизации. Подготовленные флаконы помещали в камеру лиофильной сушки. Образцы замораживали до температуры (- 40 С) в течение 3 часов, для этого полку аппарата охлаждали до температуры -45 С. Температуру образцов контролировали с помощью датчика температуры. Через три часа замораживания в камере аппарата начинали сублимационное высушивание: создавали вакуум глубиной 5 Па, конденсор охлаждали до -75 °С, полку аппарата в течение часа нагревали до + 20 °С. Образцы сыворотки при этом оставляли замороженными, так как шел интенсивный процесс сублимации. Время окончания сублимации определяли по выравниванию температур полки и образцов сыворотки. После этого начинали этап досушивания, поднимая температуру полки до +30 °С и понижая давление до 0,1 Па. Досушивание проводили пока температура образцов не достигнет 25-27 °С. По окончании досушивания, не вынимая из камеры, флаконы укупоривали под вакуумом с помощью укупоривающего устройства лиофильного аппарата. После этого флаконы вынимали из камеры, на резиновые пробки надевали алюминиевые колпачки, которые фиксировали с помощью кримпера.

Пример 3. Экспериментальное подтверждение осуществимости способа и возможности достижения указанного технического результата.

Авторами подтверждено экспериментально (метод ИФА*, метод аллергочипа ISAC "ImmunoCAP^® Allergen components" производства "Thermo Scientific") что при разных температурах хранения сырья (сывороток крови) и при лиофилизации предлагаемым авторами способом в двух вариантах уровень специфического иммуноглобулина Е (IgE антител) в СО сохраняется высокий - не менее 3 класса. Результаты оценки уровня IgE антител приведены в таблице 1 (вариант 1 способа) и в таблице 2 (вариант 2 способа). В экспериментах применялся набор реагентов для определения аллергенспецифических IgE антител "IgE-АТ-ИФТС" производства АО "НПО "Микроген".

Таблица 1 №/п № пула сывороток/ № серии лиофилизата Паспорт-ные
данные Уровень IgE антител (классы) До сушки После лиофилизации 1 Пул № 1/ серия СО_01
(хранение сырья -
-30 °С) 4 класс
(ИФА) 4 4 2 Пул № 2/ серия СО_02
(хранение сырья -
-70 °С) 4 класс
(ImmunoCap) 3 3

Таблица 2 №/п № серии сывороток Паспорт-ные
данные Уровень IgE антител (классы) До сушки После сушки 1 Пул № 3/ серия СО_03
(хранение сырья -
-30 °С) 3-4 класс
(ИФА, ImmunoCap) 4 4 2 Пул № 4/ серия СО_04
(хранение сырья -
-70 °С) 3-4 класс
(ImmunoCap) 4 3 3 Пул № 5/ серия СО_05
(хранение сырья -
-70 °С) Смесь 3-4 класса
(ImmunoCap) 4 4

Аттестации кандидатов в СО лиофилизатов аллергенспецифической сыворотки была проведена по следующим показателям: «Описание», «Подлинность», «Однородность массы», «Герметичность», «Растворимость», «Вода», «Содержание IgE антител»; «Специфическая активность» (таблицы 3-4). Исследования по вышеуказанным параметрам проводились стандартными методами, изложенными в ГФ XIV. Параметры аттестации были выбраны с учетом современных требований, предъявляемых к биологическим стандартам («European Pharmacopoeia (Ph. Eur.)» - 9th Edition, «Рекомендации по производству, описанию характеристик и утвержденных международных и других биологических стандартных образцов» - 2006. - Серия технических отчетов ВОЗ. - № 932).

Результаты испытаний лиофилизированной формы стандартного образца сыворотки, содержащей специфический иммуноглобулин Е, полученной по способу варианта 1 и варианта 2 приведены в таблице 3 и 4 соответственно и соответствуют норме по всем показателям.

Таблица 3 №/п Показатели Норма Серия_01 Серия_02 1. Описание Лиофилизат в виде таблетки от светло-жёлтого до тёмно-жёлтого цвета. Таблетка светло-жёлтого цвета Таблетка светло-жёлтого цвета 2. Подлинность Должна образовывать комплекс АГ-АТ с аллергеном из пыльцы амброзии (ОП лунок с сывороткой более, чем в 1,5-2 раза выше, чем уровень лунок Blank) ОП лунок с сывороткой более, чем в 2 раза выше, чем уровень лунок Blank ОП лунок с сывороткой более, чем в 2 раза выше, чем уровень лунок Blank 3. Однородность массы Коэффициент вариации должен быть не более 2 % 0,98 0,80 4. Герметичность Флаконы должны быть герметичны Герметичны Герметичны 5. Растворимость Не более 1,5 мин < 1 мин < 1 мин 6. Вода Не более 3 % 2,03 1,56 7. Содержание IgE антител Не менее 3 класса 4 класс 3 класс 8. Специфическая активность Рабочее разведение сыворотки, при котором
уровень ОП в лунках с положительным контролем
≥ 1,0;
калибровочная кривая должна быть дозозависимой:
R² ≥ 0,95;
наклон 0,70 ≤ b ≤ 1,40;
минимальный уровень ОП должен превышать в 1,5-2 раза уровень ОП Blank; максимальный - не менее 1,0. Рабочее разведение
1:4 Рабочее разведение
1:2 9. Срок годности На 01.12.2022 41 мес. 39 мес. 10. Хранение Не выше - 20 °С < - 20 °С < - 20 °С

Таблица 4 №/п Показатели Норма Серия_03 Серия_04 Серия_05 11. Описание Лиофилизат в виде таблетки от светло-жёлтого до тёмно-жёлтого цвета. Таблетка светло-жёлтого цвета Таблетка светло-жёлтого цвета Таблетка светло-жёлтого цвета 12. Подлинность Должна образовывать комплекс АГ-АТ с аллергеном из пыльцы амброзии (ОП лунок с сывороткой более, чем в 1,5-2 раза выше, чем уровень лунок Blank) ОП лунок с сывороткой более, чем в 2 раза выше, чем уровень лунок Blank ОП лунок с сывороткой более, чем в 2 раза выше, чем уровень лунок Blank ОП лунок с сывороткой более, чем в 2 раза выше, чем уровень лунок Blank 13. Однородность массы Коэффициент вариации должен быть не более 2 % 1,5 1,5 1,5 14. Герметичность
(вакуум/герметизация) Должны наблюдаться голубое свечение Наблюдается голубое свечение Наблюдается голубое свечение Наблюдается голубое свечение 15. Растворимость Не более 1,5 мин < 1 мин < 1 мин < 1 мин 16. Вода Не более 3 % 0,57 0,52 0,61 17. Содержание IgE антител Не менее 3 класса 4 класс 4 класс 4 класс 18. Специфическая активность Рабочее разведение сыворотки, при котором
уровень ОП в лунках с положительным контролем
≥ 1,0;
калибровочная кривая должна быть дозозависимой:
R² ≥ 0,95;
наклон 0,70 ≤ b ≤ 1,40;
минимальный уровень ОП должен превышать в 1,5-2 раза уровень ОП Blank; максимальный - не менее 1,0. Рабочее разведение
1:4 Рабочее разведение
1:10 Рабочее разведение
1:4 19. Срок годности На 01.12.2022 14 мес. 14 мес. 14 мес. 20. Хранение Не выше - 20 °С < - 20 °С < - 20 °С < - 20 °С

По результатам оценки стабильности в реальном времени срок хранения разных серий кандидатов в СО составил от 14 до 41 месяцев, что уже как минимум в 2 раза выше по сравнению с условиями хранения для жидкой формы сывороток. Предполагаемый срок хранения - 5 лет с последующим ретестом. Этот срок был рекомендован по результатам оценки содержания специфического иммуноглобулина Е в экспериментальных сериях лиофилизированных образцов сывороток, которые были изготовлены для отработки условий лиофилизации и методик оценки аллергенной активности.

Оценка стабильности содержания специфического IgE в лиофилизированных образцах сывороток методом ИФА приведена в таблице 5 (как видно из таблицы, содержание специфического IgE в образцах через 7 лет после лиофилизации не изменилось). Метод ИФА изложен в ОФС «Подлинность аллергенов» (ГФ XIV), сырье до лиофилизации хранилось в одинаковых условиях (при 2-8 ⁰С в течении 3-5 дней, серии КС_3, КС_7, КС_8) и в разных условиях (при 2-8 ⁰С и при -30 ⁰С, серии КС_10 и КС_9), лиофилизаты хранились при температуре ниже - 20 ⁰С.

Таблица 5 №/п Шифр экспериментальной серии Содержание специфического IgE в классах 2015 г. 2022 г 1. КС_3 - сыворотка, содержащая специфический IgE к аллергену из пыльцы березы 4 4 2. КС_10 - сыворотка, содержащая специфический IgE к аллергену из пыльцы березы 3 3 3. КС_7 - сыворотка, содержащая специфический IgE к аллергену из пыльцы тимлфеевки 3 3 4. КС_8 - сыворотка, содержащая специфический IgE к аллергену из пыльцы ежи 4 4 5. КС_9 - сыворотка, содержащая содержащая специфический IgE к аллергену из пыльцы ежи 4 4

СО аллергенспецифических сывороток, изготовленных по заявленной технологии, были использованы при разработке методики ИФА-ингибиции для оценки аллергенной активности. В таблице 6 приведены сводные результаты валидационных исследований, которые позволяют рекомендовать данную методику для оценки активности препаратов аллергенов, где МЕ - международные условные единицы активности препаратов аллергенов, в качестве СО в методике использовались международные СО аллергенов.

Таблица 6 Валидационные характеристики Критерий Результат Заключение Специфичность Аллерген образует комплекс только с аллергенспецифической сывороткой Аллергены из пыльцы амброзии, березы, тимофеевки взаимодействовали только с одноименными сыворотками Методика охарактеризована как специфичная Линейность Коэффициент детерминации R² ≥ 0,95 0,99 Методика охарактеризована как линейная Чувствительность Не ниже минимальной концентрации СО < 10 МЕ**/мл Соответствует критерию Правильность Степень извлечения ± 20 % +4,17 Точность методики подтверждена Повторяемость Коэффициент вариации ≤ 10 % 4,51 Методика охарактеризована как воспроизводимая Прецизионность Коэффициент вариации ≤ 20 % 13,32

Была проведена оценка возможности замены СО предприятия (жидкая аллергенспецифическая сыворотка) на СО аллергенспецифической сыворотки, изготовленной по заявленной технологии, в методике кИФА, разработанной АО "ФГУП "НПО "Микроген". Результаты оценки активности кандидата в СО аллергена из пыльцы амброзии методом кИФА приведены в таблице 7, где ЕАА - единицы аллергенной активности - условные единицы, рекомендуемые в РФ для оценки активности препаратов аллергенов (ОФС "Аллергены", ГФ XIV). В качестве СО аллергена был использован СО предприятия «Микроген» (жидкий аллерген), в качестве исследуемого образца - лиофилизированная форма кандидата в СО аллергена из пыльцы амброзии.

Таблица 7 №/п Исследуемы параметры Аллергенспецифическая сыворотка Эталон - СО предприятия (жидкая сыворотка) Лиофилизированная форма кандидата в СО 1. Активность (ЕАА*/мл) 331309 301736 2. Коэффициент вариации (% )
(норма - не более 20 %) 6,9

Результаты исследований показали, что лиофилизированная форма кандидата в СО аллергенспецифической сыворотки может быть использована в методике кИФА. Коээфициент вариации между результатами, полученными с помощью эталонной сыворотки (СО предприятия) и лиофилизатом составил 6,9 %, что почти в раза меньше максимально допустимого значения.

При отработке технологии получения лиофилизированных IgE содержащих сывороток, выяснилось, что при смешивании образцов от разных пациентов в пуле может формироваться желеобразная масса небольшого объема (не более 10 % от общего объема). Вышеуказанная масса визуально становилась заметной спустя лишь несколько часов после смешивания отдельных сывороток. Поэтому авторами было проведено исследование по выявлению временного интервала появления наибольшего объема агглютинирующей биомассы. Для этого, после объединения сывороток от нескольких пациентов пул помещали на 5 мин на магнитную мешалку при комнатной температуре и средней скоростью перемешивания (400 rpm). Далее, пул переносили в холодильную камеру (+ 2-8 °С) на сутки. В течение этого интервала емкость с пулом вынимали и осматривали на предмет образования желеобразной массы. Результаты определения минимального интервала стабилизации пула сывороток приведены в таблице 8.

Таблица 8 Время после смешивания (часы) 1 4 15 17 19 21 Описание пула Прозрачный раствор В прозрачном растворе наблюдается желеобразная масса
(менее 10 % от общего объема) В прозрачном растворе наблюдается желеобразная масса (примерно 10 % от общего объема)

Как видно из таблицы 6 наибольший выход этой массы приходился через 15 часов после смешивания. В дальнейшем, период - с 15 ч до 21 ч объем желеобразной массы не менялся. Осадок из пула удаляли через марлевый фильтр. По результатам проведенных исследований было рекомендовано ввести этап стабилизации пула в течение 15 часов после смешивания сывороток.

Таким образом, авторами разработана простая в применении технология получения стандартных образцов аллергенспецифических сывороток, которая позволяет получать стандартные образцы со стабильно высоким уровнем специфического иммуноглобулина E, с возможностью их применения для оценки качества препаратов аллергенов методом ИФА, с увеличением срока хранения без потери качества стандартного образца.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ получения лиофилизированной формы стандартного образца сыворотки, содержащего аллергенспецифический иммуноглобулин Е (варианты). В одном из вариантов реализации способ включает этапы хранения сыворотки, стабилизации пула и лиофилизации стандартного образца. Изобретение расширяет арсенал способов получения лиофилизированной формы стандартных образцов аллергенспецифических сывороток, необходимых при оценке качества препаратов аллергенов. 2 н.п. ф-лы, 8 табл., 3 пр.

1. Способ получения лиофилизированной формы стандартного образца сыворотки, содержащего аллергенспецифический иммуноглобулин Е, включающий этапы хранения сыворотки, стабилизации пула и лиофилизации стандартного образца, при этом сыворотки хранят при температуре от +8°С до -70°С, стабилизацию пула проводят путем отстаивания образца сыворотки в течение 15 часов с дальнейшей фильтрацией образца сыворотки и внесением антимикробного вещества, далее разливают по флаконам и переходят к этапу лиофилизации путем последовательного замораживания образца сыворотки и лиофильной сушке на установке аппаратного типа, а именно образец сыворотки замораживают при температуре -70°С в течение 5 часов и далее лиофилизируют в лиофильной сушке в течение 17 часов при остаточном давлении 0,2-0,08 Па.

2. Способ получения лиофилизированной формы стандартного образца сыворотки, содержащего аллергенспецифический иммуноглобулин Е, включающий этапы хранения сыворотки, стабилизации пула и лиофилизации стандартного образца, при этом сыворотки хранят при температуре от +8°С до -70°С, стабилизацию пула проводят путем отстаивания образца сыворотки в течение 15 часов с дальнейшей фильтрацией образца сыворотки и внесением антимикробного вещества, далее разливают по флаконам и переходят к этапу лиофилизации путем последовательного замораживания образца сыворотки и лиофильной сушке на установке камерного типа, а именно образец сыворотки замораживают при температуре -40°С в течение 3 часов, далее создают вакуум 5 Па при температуре конденсора -75°С, температуре полки 20°С, далее поднимают температуру полки до 30°С при 0,1 Па и досушивают до достижения температуры образцов 25-27°С.