Способ диагностики атопической бронхиальной астмы Советский патент 1993 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к области клинической иммунологии и аллергологии.

Целью способа является повышение точности этиологической диагностики бронхиальной астмы.

Выбор специфических ИгЕ-антител в составе иммунных комплексов обусловлен тем, что ИгЕ-антитела являются маркером аллергического процесса.

Предлагаемый способ позволяет.диагностировать посредством определения аллергенспецифических ИгЕ-антител причинный аллерген, вызывающий бронхиальную астму. Это важно для своевременного назначения патогенетической терапии.

Предлагаемый способ позволяет провести этиологическую диагностику атонической бронхиальной астмы в 9 и более раз точнее.

Для осуществления предлагаемого способа из сыворотки крови выделяют циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) методом селективной преципитации с поли- этиленгликолем (М.в. 6000) в конечной концентрации 3,75%. Полученный преципитат ЦИК осаждают центрифугированием при 5000 об/мин, дважды отмывают полиэти- ленгликолем этой же концентрации. Затем отмытый осадок подвергают диссоциации 0.05М глицин -HCI буфером, рН 2,6, в термостате при 37°С в течение 1 часа..После диссоциации иммунных комплексов специфические ИгЕ-антитела определяют в пробе на тест-системе иммуноферментной для определения аллергенспецифических ИгЕ-антител человека, изготовленной Ставропольским НПО Аллерген.

Способ осуществляют следующим образом.

К 0,2 мл сыворотки крови добавляют 0,4 мл боратного буфера, рН рН 8,6, 0,1 М, перемешивают и добавляют 5,4 мл раствора полиэтиленгликоля (М.в. 6000) в конечной концентрации 3.75%, приготовленного на боратном буфере. Перемешивают и оставляют при комнатной температуре для образования преципитата на 1 час. Затем переливают в пластмассовые пробирки для центрифуги ОПН-8 и центрифугируют при

сл

с

00 Сл

го

ч

5000 об/мин 20 мин, однако с учетом времени на разгон и остановку ротора время центрифугирования увеличивается до 35 мин. Супернатант сливают и добавляют в пробирки холодный раствор полиэтиленглико- ля этой же концентрации, перемешивают и снова центрифугируют. Операцию отмывки повторяют еще раз. Слив супернатант, к осадку добавляют 0,2 мл 0.05М глицин-НС1 буфера, рН 2,6 для диссоциации иммунных комплексов.

Перемешивают и оставляют в термостате при. 37°C на 1 ч. В приготовленной таким образом пробе определяют содержание специфических ИгЕ-антител домашней пыли на тест-системе иммуноферментной для определения аллергенспецифических ИгЕ- антител человека, изготовленной Ставропольским НПО Аллерген. Инструкция по работе прилагается к каждому набору тест- системы.

Учет результатов проводят инструментально, на спектрофотометре типа Мульти- скан при длине волны 492 нм. Оценка содержания специфических ИгЕ-антител производится на основе определения оптической плотности (ОП) продукта ферментативной реакции, характеризующей содержание аллергенспецифических ИгЕ- антител. Для этого рассчитывают среднюю арифметическую ОП дублей всех растворов (А,В,С,Д) стандарта: ИгЕ-антител и образцов тестируемых сывороток. ОП образцов сравнивают с ОП растворов (А,В,С.Д) стандарта ИгЕ-антител (см.таблицу 1).

Для удобства расчетов единицы оптической плотности умножены на 1000 (см.табл.2).

Оценка содержания специфических ИгЕ-антител может быть произведена по степени реакции (в плюсах от 0,1,2,3,4), что соответствует отрицательному, низкому, умеренному, высокому и очень высокому уровню ИгЕ-антител. Однако такой подход не позволяет провести тщательную и точную оценку результатов/Поэтому мы считали необходимым рассмотреть цифровые данные ОП, полученные на спектрофотометре Мультискан, которые количественно и, соответственно, более реально отражали бы истинное соотношение специфических ИгЕ-антител в сыворотке крови и составе ЦИК у детей с бронхиальной астмой. Благодаря количественному анализу ОП образцов, нами установлено, что содержание специфических ИгЕ-антител домашней пыли, независимо от периода болезни у детей с бронхиальной астмы, было достоверно выше в составе ЦИК, чем в сыворотке крови (см. таблицу 2). Так, содер0

жание ИгЕ-антител к домашней пыли в составе ЦИК было в среднем 9,346 раза выше, чем в сыворотке крови в приступном периоде и ев 30, 14 раза в межприступном перио- де болезни. Значительно выше было содержание ИгЕ-антител к домашней пыли в приступном периоде по сравнению с меж- приступным периодом (Р,001). Т.о., нами установлено, что максимальное количество специфических ИгЕ-антител домашней пыли содержится не в сыворотке крови, а в составе ЦИК. Следовательно, для этиологической диагностики бронхиальной астмы практическое значение имеет определение аллергенспецифических ИгЕ-антител не столько в сыворотке крови, сколько в составе ЦИК. При этом определение специфических ИгЕ-антител в составе ЦИК более информативно и коррелирует с остротой аллергического процесса, выраженностью клинической симптоматики заболевания.

П р и м е р 1. Ребенок Катя Г., 2 г 11 мес. находилась в стационаре с клиническим диагнозом: бронхиальная астма, атоническая форма, тяжелое течение, астматический статус. Приступы бронхиальной астмы частые, причинный аллерген не выявлен. Для установления этиологического диагноза бронхи- альнойастмыпоставлены

скарификационные кожные пробы на аллерген домашней пыли, результаты которых были отрицательными. При иммунологическом обследовании уровень свободно циркулирующих специфических ИгЕ-антител к домашней пыли в сыворотке крови равен 105 ед, (++), т.е. умеренный, а содержание специфических ИгЕ-антител к домашней пыли по предлагаемому способу в составе ЦИК сыворотки крови - 1012 ед (++++), т.е. очень высокий, Последнее убедительно свидетельствует о наличии аллергии к домашней пыли у ребенка с бронхиальной астмой, т.е. установлен конкретный этиологический диагноз.

П р и м е р 2. Ребенок Костя Б., 9 лет, находился в стационаре с клиническим диагнозом: бронхиальная астма, атоническая, тяжелое течение, приступный период. Страдает бронхиальной астмой в течение 7 лет, приступы почти ежедневные, причинный ал- лерген не выявлен. Для установления этиологического диагноза бронхиальной астмы в светлом промежутке поставлены скарификационные кожные пробы на аллерген домашней пыли. Результаты последних были отрицательными. При иммунологическом обследовании уровень свободно циркулирующих специфических ИгЕ-антител к домашней пыли в сыворотке крови равен 92 ед. (+) т..е низкий. Содержание специфических

0

5

0

5

0

5

0

5

ИгЕ-антител к домашней пыли по предлагаемому способу в составе ЦИК сыворотки крови - 975 ед. (+++), т.е. очень высокий, что свидетельствует о наличии аллергии к домашней пыли и позволяет установить конк- ретный этиологический диагноз.

П р и м е р 3. Ребенок Алексей Ч., 7 лет, находился в стационаре с клиническим диагнозом: бронхиальная астма, атоническая, средней тяжести, межприступный период. Страдает бронхиальной астмой в течение 3 лет, приступы частые, хотя в последний год стали реже, последний приступ за неделю до обследования. Для установления этиологического диагноза бронхиальной астмы по- ставлены скарификационные кожные пробы, выраженность которых была слабой (+) и поэтому не подлежал к проведению патогенетического лечения - специфической иммунотерапии виновным аллергеном. При иммунологическом обследовании уровень свободно циркулирующих ИгЕ-антител к домашней пыли в сыворотке крови равен О ед. (-), т.е. отрицательный, а содержание специфических ИгЕ-ангител к домашней пыли по предлагаемому способу в составе ЦИК - 489 ед. (+++), т.е. высокий. Это свидетельствует о наличии аллергии к домашней пыли, т.е. установлен конкретный этиологический диагноз.

П р и м е р 4. Ребенок Андрей Д., 8 лет, находился в стационаре с клиническим диагнозом: бронхиальная астма, атоническая, средней тяжести, постприступный период. Страдает бронхиальной астмой в течение 2 лет. Для установления этиологического диагноза бронхиальной астмы поставлены скарификационные кожные пробы на аллерген домашней пыли, результаты которых оказались отрицательными. При иммуноло- гическом обследовании уровень свободно циркулирующих ИгЕ-антител к домашней пыли в сыворотке крови равен 63 ед. (+), т.е низкий, а содержание специфических ИгЕ- антител к домашней пыли по предлагаемо- му способу в составе ЦИК сыворотки крови -596 ед.(+++), т.е. высокий. Это свидетельствует о сенсибилизации организма аллергеном домашней пыли, т.е. установлен конкретный этиологический диагноз.

Таким образом, использование предлагаемого способа аллергенспецифической

диагностики атонической бронхиальной астмы имеет по сравнению прототипом следующие преимущества: 1) Предлагаемый способ по точности обнаружения специфических ИгЕ-антител в организме в 9 и более раз превышает ранее известный, поскольку аллергенспецифические ИгЕ-антитела в составе циркулирующих иммунных комплексов выявляются даже тогда, когда в сыворотке крови свободно циркулирующие ИгЕ-антитела не обнаруживаются или присутствуют в очень низких количествах; 2) позволяет проводить этиологическую диагностику атонической бронхиальной астмы в любом периоде болезни, в том числе и в период приступа; 3) может быть использован с высокой степенью надежности и в межприступном периоде болезни при отрицательной реакции кожных проб, а также при поврежденной коже или наличии в анамнезе анафилактических реакций; 4) использование способа основано на выделении из сыворотки крови циркулирующих иммунных комплексов, их последующей диссоциации на антиген и антитело. Для определения ИгЕ-антител используют им- муноферментные тест-системы; 5} способ несложен в техническом исполнении и может быть применен в любой иммунологический лаборатории при наличии спектрофотометра Мультискан и центрифуги ОПН-8.

Таким образом, предлагаемый способ выявления аллергенспецифических ИгЕ-антител высокодостоверен и может быть использован в лечебных учреждениях в качестве теста для выявления причинного аллергена.

Формула изобретения Способ диагностики атопической бронхиальной астмы путем определения содержания специфических lgE-антител к домашней пыли в организме, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, специфические lgE-ан- титела к домашней пыли определяют в составе циркулирующих иммунных комплексов сыворотки крови и при выявлении их уровня от 400 ед. и более диагностируют бронхиальную астму, вызванную аллергией к домашней пыли.

Т а б л и ц а 1

Изобретение относится к медицине, а именно к области клинической иммунологии и аллергологии. Целью способа является повышение точности этиологической диагностики атоп ической бронхиальной астмы. Поставленная цель достигается благодаря тому, что предложено определение содержания аллергенспецифических ИгЕ-антител к домашней пыли в составе циркулирующих иммунных комплексов сыворотки крови и при выявлении высокого уровня (от 400 ед. и более) аллергенспецифических ИгЕ-антител к домашней пыли диагностируют бронхиальную астму, вызванную аллергией к домашней пыли. 2 табл.

п х jSx

1010

115,6+1 ,58 335,,it5

ИгЕ ЦИК

и г Е сы в.х j Sx

Э.,435

Примечание. efl. О.П. умножены на 1000; П - приступный, М - ме)«приступный

Таблица2

26 ,62+9 ,68

26 S i7,()7,23

30,

1,3 0,02

2,1) 40,001 1,3 0,C01 3,(i 0,001

П.H. 0,05