Способ получения белкового гидролизата Советский патент 1991 года по МПК C12N1/20 

сл

с

Изобретение относится к производству биохимических препаратов и может найти применение в микробиологической промышленности, а также в фармацевтической промышленности для контроля стерильности лекарственных средств. Целью изобретения является повышение качества белкового гидролизата за счет обеспечения высокого содержания аминного азота. Способа заключается в том. что в качестве исходного сырья используют отходы - фарш свиных почек после выделения аминоацила- зы, причем отработанный почечный фарш перед гидролизом подвергают термообработке при 85-95°С в течение 10-20 мин, гидролиз осуществляют при рН 7,4-8,0 и непрерывном перемешивании, а балластные белки от гидролизата отделяют при рН 4.7-5,5. 4 табл.

Изобретение относится к производству биохимических препаратов и может найти применение в микробиологической промышленности, а также в фармацевтической промышленности для контроля стерильности лекарственных средств.

Целью изобретения является повышение качества белкового гидролизата за счет обеспечения высокого содержания аминного азота.

Способ осуществляется следующим образом,

В качестве исходного сырья используют отходы - фарш свиных почек после выделения аминоацилазы, причем отработанный почечный фарш перед гидролизом подвергают термообработке при 85-95°С в течение 10-20 мин, гидролиз осуществляют при рН 7,4-8,0 и непрерывном перемешивании, а балластные белки от гидролизата отделяют

при рН 4,7-5,5 и постоянное значение рН в процессе гидролизата поддерживают карбонатом или бикарбонатом натрия.

Термообработка почечного фарша при 85-95°С в течение 10-20 мин способствует денатурации белка, что приводит к повышению чувствительности к протеолитическим ферментам.

Однако при длительном нагреве или нагреве при более высоких температурах устойчивость белков к ферментам либо не меняется, либо повышается. Оптимальной является термообработка при 85-95°С в течение 10-20 мин. Предварительная термообработка обеспечивает также дополнительную защиту от роста посторонней микрофлоры в процессе гидролиза.

Почки содержат около 10% полноценных белков, богаты витаминами и микроэлементами. По содержанию отдельных

О

(л

2

Ю

витаминов и микроэлементов почки превосходят говядину. Применение в качестве исходного сырья почечного фарша позволяет получить гидролизат, содержащий ростовые вещества, неорганические соединения фосфора, калия, магния, железа, а также микроэлементы: медь, марганец, молибден,

Ведение процесса гидролиза панкреатином при непрерывном перемешивании (массообмена при ферментативном гидро- л изе имеет большое значение) и рН 7,4-8,0 интенсифицирует процесс и повышает качество гидролизата, так как увеличивает количество свободных аминокислот. Гидролизат содержит 65-80% свободных аминокислот 16 наименований, среди них незаменимые аминокислоты: аргинин, валин, гистидин, изолейцин, лизин, лейцин, метионин,треонин, фенилаланин. Отделение негидролизо- ванного белка при рН 4,7-5,8 предохраняет От выпадания в осадок фосфорсодержащих соединений, некоторых катионов.

Данные изменения показателей качества гидролизата в зависимости от рН приведены в табл, 1,

При более низком значении рН увеличивается зольность получаемого препарата, при повышении рН уменьшается доля свободных аминокислот. В интервале рН 4,7- 5,5 при нагревании быстро происходит коагуляция негидролизованного белка, а также уменьшаются затраты времени на фильтрование.

Пример 1. В стеклянный реактор с рубашкой (объем 20 л) заливают 12 л деминерализованной воды и нагревают до 85°С. Включив мешалку, загружают в реактор 6 кг почечного фарша, отходы после выделения аминоацилазы. Температуру смеси доводят до 85°С и выдерживают при данной температуре в течение 10 мин. Затем температуру в реакторе снижают до 38-42°С, устанавливают рН 8,0 добавлением карбоната или бикарбоната натрия и вводят панкреатин в виде суспензии в количестве 120 г. Через 30 мин, а затем через 1 ч проверяют реакцию смеси и при необходимости подщелачивают до рН 7,4. Добавляют в реактор 150 мл хлороформа. Гидролиз ведут при рН 7,4 при постоянном перемешивании при 38-42°С в течение 24 ч. По окончании гидролиза смесь подкисляют добавлением кислоты до рН 4,7, температуру в реакторе поднимают до 90°С и, выключив мешалку, выдерживают смеЈь при указанной температуре в течение 0,5-1,0 ч. Полученный гидролизат фильтруют через капроновый фильтр. В фильтрате определяют содержание аминного азота, равное 710 мг%

Пример 2. В стеклянный реактор с рубашкой (объем 20 л) заливают 12 л деминерализованной воды и нагревают до 88°С. Включив мешалку, загружают 6 кг почечного

фарша, отходы после выделения аминоацилазы. Температуру смеси поднимают до 88°С и выдерживают при данной температуре в течение 15 мин. Смесь охлаждают до 38-42°С, устанавливают рН 8.0 добавлением

0 карбоната или бикарбоната натрия и вводят панкреатин в виде суспензии в количестве 120 г. Через 30 мин после добавления фермента проверяют реакцию смеси и подщелачивают до рН 8,0. Через 1 ч проводят

5 повторную корректировку рН. В реактор вводят 150 мл хлороформа и ведут гидролиз при непрерывном перемешивании при рН 7,8 и 38-42 С в течение 24 ч. Содержимое реактора подкисляют до рН 5,2, температу0 ру в реакторе доводят до 90°С и, выключив мешалку, выдерживают смесь при данной температуре в течение 0,5-1.0 ч. Полученный гидролизат фильтруют через капроновый фильтр. В фильтрате определяют содержа5 ние аминного азота, равное 690 мг%.

Пример 3. В стеклянный реактор с рубашкой (объем 20 л) заливают 12 л деминерализованной воды и нагревают до 95°С. Включив мешалку, загружают 6 кг почечного

0 фарша. Температуру смеси поднимают до 95°С и выдерживают приданной температуре в течение 20 мин. Смесь охлаждают до 38-42°С, устанавливают рН 8,0 добавлением карбоната или бикарбоната натрия и вводят

5 панкреатин в виде суспензии в количестве 120 г. Через 30 мин после добавления фермента проверяют реакцию смеси и подщелачивают до рН 8,0. Через 1 ч проводят повторную корректировку рН. В реактор

0 вводят 150 мл хлороформа и ведут гидролиз при непрерывном перемешивании при рН 8,0 и 38-42°С в течение 24 ч. Затем содержимое реактора подкисляют кислотой до рН 5,5, температуру в реакторе доводят до 90°С и,

5 выключив мешалку, выдерживают смесь при данной температуре в течение 0,5-1,0 ч. Полученный гидролизат фильтруют через капроновый фильтр. В фильтрате определяют содержание аминного азота, равное 680

0 мг%.

Пример 4. Отмеряют 1 л дистиллированной воды, 13 г агара Заливают 200 мл дистиллированной воды и оставляют на 30 мин для набухания, В колбу вносят 14 г

5 панкреатического почечного гидролизата 5,0 г хлорида натрия, 1,0 г глюкозы и растворяют в 800 мл дистиллированной воды при нагревании, прибавляют замоченный агар, раствор нагревают до полного его расплавления. Устанавливают рН 7,5 ±0,2. При необходимости фильтруют через ватно-мэрле- вый фильтр. Разливают в пробирки по 4 мл и в колбы по 150 мл. Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под давлением при 121°С в течение 15 мин.

Испытание ростовых свойств среды проводят с помощью контрольного штамма Bacillus cereus ATCC 10702 и другими аэробными микроорганизмами. 1 мл суточной культуры Bacillus cereus ATCC 10702 (или другого аэробного микроорганизма) вносят в 100 мл стерильного 0,9%-ного изотонического раствора хлорида натрия. По стандарту мутности для оптической стандартизации бактерийных взвесей определяют мутность полученной взвеси и соответствующую концентрацию бактерий тест-штамма. Затем готовят разведения, по 1 мл каждого раствора вносят в чашку Петри со средой и распределяют шпателем по поверхности. Инкубируют в термостате не менее 48 ч при 38°С, хотя для получения достоверных данных по ростовым свойствам среды достаточно и 24-часового инкуби- рования. Результаты оценки роста тест-штамм Bacillus cereus ATCC 10702 и других аэробных микроорганизмов после 24 ч инкубирования представлены в табл. 2.

Количественное определение общего числа бактерий с помощью предлагаемой среды и среды на мясопептонном агаре проводят двухслойным агаровым методом в чашках Петри диаметром 90-100 мм. Образец лекарственного средства в количестве 10 г растворяют или суспендируют в фосфатном буферном растворе рН 7,0 так, чтобы конечный объем раствора был 100 мл. Приготовленный раствор образца вносят по 1 мл в каждую из двух пробирок с 4 мл расплавленной и охлажденной до 45-50°С среды. Быстро перемешивают содержимое пробирки и переносят в чашку Петри, содержащую 15-20 мл застывшей питательной среды. Быстрым покачиванием чашки Петри равномерно распределяют верхний слой агара. После застывания среды чашки переворачивают и инкубируют в течение 5 сут при 30-35°С. Через 48 ч и окончательно через 5 сут подсчитывают число бактериальных колоний на двух чашках, находят среднее значение и, умножая его на показатель разведения, вычисляют число бактерий в 1 г образца.

Пример 5. В 1 л дистиллированной воды последовательно растворяют 13 г панкреатического почечного гидролизата, 7,5 г натрия фосфата двузамещенного, 2,5 г калия фосфата однозамещенного, 10 г глюкозы, прибавляют 8 мл 1%-ного раствора фенолового красного ( 0,08 г) и 3 мл 0,5%-ного раствора малахитового зеленого (0,015 г). Устанавливают рН 7,5-0,2 и кипятят 1 мин, фильтруют через бумажный фильтр. Стерилизуют насыщенным паром под давлением 5 при 121°С в течение 15 мин в паровом стерилизаторе.

Ростовые свойства предлагаемой среды определяют с помощью тест-штамма Escherichia сЫ АТСС 25922, Salmonella

10 typhl.1 мл суточной культуры Escherichia coli или Salmonella typhl вносят в 100 мл стерильного 0,9%-ного изотонического раствора хлорида натрия. По стандарту мутности для бактерийных взвесей определяют мут5 ность полученной взвеси и соответствующую концентрацию бактерий тест-штамма. Затем готовят разведение, по 1 мл каждого раствора вносят в колбу со 100 мл питател ь- ной среды и инкубируют в термостате при

0 температуре 30-35°С в течение 24-48 ч.

Результаты приведены в табл. 3. Предлагаемую питательную среду испытывают при контроле на микробиологиче5 скую чистоту нестерильных лекарственных средств для выявления бактерий семейства Enterobacteriaceal. Испытания проводят по следующей методике: образец лекарственного средства в количестве 10 г вносят в 100

0 мл питательной среды, перемешивают и инкубируют при 30-35°С в течение 24-48 ч. Наличие роста определяют по помутнению среды, а также газообразованию. Для сравнения используют среду на мясопептонном

5 бульоне по прототипу.

Данные по выявлению бактерий семейства Enterobacteriaceae в лекарственных препаратах и вспомогательном сырье приведены в табл. 4.

0 Как видно, предлагаемая питательная среда позволяет проводить выявление бак- , терий семейства Enterobacteriaceae на уровне среды на мясопептонном бульоне.

5Полученный гидролизат используется

для приготовления питательных сред, которые применяются в микробиологической промышленности и в фармацевтической промышленности для контроля стерильно0 сти лекарственных средств, в частности при контроле микробной загрязненности нестерильных лекарственных средств и вспомогательного сырья на средах с разными источниками азотного пита ния.

5Формула изобретения

Способ получения белкового гидролизата включающий гидролиз исходного сырья панкреатином, инактивацию фермента, отделение балластных белков и осветление целевого продукта, отличающийся

тем, что, с целью повышения качества белкового гидролизата за счет обеспечения высокого содержания аминного азота, в качестве исходного сырья используют почечный фарш после водной экстракции ами- ноацилазы, причем исходный материал

Примечани е.++++-сплошной, обильный рост тест-культуры; +++-хороший рост, масса слившихся колоний ; ++-умеренный рост; - -отдельные колонии и накопление колоний, т.е. имеется рост микроорганизмов.

перед гидролизом подвергают термообработке при 85-95°С в течение 10-20 мин, гидролиз осуществляют при рН 7,4-8,0 и непрерывном перемешивании, а балластные белки от гидролизата отделяют при рН 4,7-5,5.

Таблица 1

10

Таблица 2

Примечание. +++-сильное помутнение и газообразование; ++-умеренное помутнение и газообразование; +-помутнение (во всех случаях изменения цвета среды с красно-коричневого на оранжевый).

Таблица 3

Таблица 4