Питательная среда для культивирования пневмококков Советский патент 1986 года по МПК C12N1/20 

1

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в производстве вакцино-сывороточных препаратов и бактериологической диагностике.

Целью изобретения является повышение выхода биомассы пневмококка в капсульной форме за счет модификации среды, приближающей условия культивирования к естественным в организме

человека.

I

Среду готовят следующим образом.

1 кг свежезамороженной плаценты режут на кусочки размером 10-15 см и помещают в бутыль, в которую предварительно наливают подщелоченную раствором 20%-нЬй щелочи NaOH водопроводную воду, затем вносят 100 г панкреатина 45 ЕА единиц активности , хорошо перемешивают и общий объем доводят до 5 л, добавляют 50 мл хлороформа. Бутыпь закрывают резиновой пробкой и помещают на 18-20 ч в термостат при 40-43°С. Через 3-4 ч переваривания коррегируют рН-раствором 20%-ной щелочи. Через 18-20 ч гидролиза содержимое бутыли сливают в варочную кастрюлю, подкисляют концентрированной уксусной кислотой до рН 4,3-4,6 и кипятят 10 мин. Гидролизат фильтруют через тонкое фильтровальное полотно. В гидролизате определяют содержание аминного азота (600-700 мг%) и содержание сухого остатка (6,3-7,4%).

Навески компонентов вносят в дистиллированную воду в следующей последовательности: гидролизат плаценты с учетом содержания сухого остатка (при остатке 6,3% вносят 350 мл т.е 23,8 г): агар-агар 15 г; f-цистин 0,040 г; экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) 3,0 г; хлорид натрия 4,0, г; сахарозу 10 г, Общий объем доводят дистиллированной водой до 1 л рН готовой среды 7,4-7,6.

П р и м е р- 1 . Готовят среду следующего состава, г/л: Гидролизат плаценты с сухим

остатком 6,3% 20,4 Агар-агар14,0

г-Цистин0,038

ЭКД2,8

Хлористый натрий 3,5 Сахароза9,0

619482

Дистиллированная , водаДо 1 л

Пример 2 . Готовят среду следующего состава, г/л: 5 Гидролизат плаценты с содержанием сухого остатка 6,37,4%23,8

Агар-агар15,0

Р-Цистин0,04

ЭКЦ3,0

Хлористый натрий 4,0 Сахароза10,0

Вода дистиллированнаяДо 1 л Приме р 3. Готовят питательную среду следующего состава, г/л: Гидролизат плаценты с содержанием сухого остатка 6,37,4%27,2 Агар-агар (высший сорт)16 Е-Цистин 0,05 ЭВД 3,5 Хлористый натрий 4,2 Сахароза 11,0 Дистиллированная вода До 1 л Выход биомассы при выращивании на 3 вариантах среды и посевной дозе 100000 клеток пневмококка на чашку приведен в таблице.

Скорость роста пневмококков на питательной среде 12-18 ч. 35 Плотная питательная среда на основе гидролизата плаценты человека без добавления сыворотки и крови позволяет получать микробную массу, свободную от балластных веществ. 40 Приготовленная на сконструированной среде вакцина впервые позволила получить пневмококковые сьшоротки со специфическим спектром антител. В серологических реакциях отмечалась одна 45 линия преципитации против специфических полисахаридов пневмококка, Реакции против других полисахаридов и сыворотки крупного рогатого скота отсутствуют. Титры полученных сы50 вороток имеют значения 1:640-1:1280. По чувствительности среда на основе гидролизата плаценты человека не уступает контрольным средам, а в отдельных случаях превосходит их. 55 При посеве 0,05 мл взвеси культуры пневмококка при исходной концентрации 10 ЕД по стандарту мутности ГИСК

.б

им. Тарасевича из разведения 2-10 3 на .месте нанесения капель отмечается рост единичных колоний пневмококка. Среда на основе гидролизата плаценты человека позволяет выделять пневмококк из патологического материала. П р и м е р 4. Вьщеление пневмококка из мокроты. Гнойно-слизистый комок мокроты трехкратно отмывают физиологическим раствором. Затем изготовляют мазок, окрашивают по Граму и подвергают микроскопии для контроля за качеством отмывки и решения вопроса о направлении и объеме последующего культурального исследования. Затем мокроту гомогенизируют. Из гомогената готовят 6 десятикратных разведений на физиологическом растворе Петлей, откалиброванной на 0,01 мл разведения, засевают 7 окружностей с диаметром 25 мм, приготовленных нагретой пробиркой в чашке Петри с кровяным агаром. После 12-18 ч инкубации производят подсчет колоний и идентификацию микробов. Для определения количества бактерий в 1 мл количество колоний в секторе необходимо умножить на 100 и на степень разведения. Показатели 10 и менее характерны для сопутствующей микрофлоры, - могут указывать на эти ологическую роль микроба, 10 и более свидетельствуют в пользу участия микроба в патологическом процессе, С целью создания селективных усло вий для вьщеления определенных микро бов посев производят следующим образом. После предварительной отмывки, го могенизации и приготовления исходного разведения 1;10 проводят посев исследуемого материала на питательну среду следующим образом; 0,1 мл наносят на чашку Петри и распределяют стеклянным шпателем равномерно по по верхности агара. Далее на засеянную 484 исследуемым материалом поверхность агара накладывают 1-2 сапониновых или сапонино-бацитроциновых диска на расстоянии 2 см друг от друга, а на противоположный край - диск с мономицином или гентамицином. Посевы инкубируют в аэробных условиях в термостате при 36-37 С в течение 1218ч, либо в атмосфере СО (эксикатор с горящей свечой). Затем учитывают характер роста и морфологию колоний. На кровяном агаре пневмококки образуют мелкие колонии, полупрозрачные в проходящем свете, с приподнятым краем и центром блюдце, а R-формы пневмококков - сферические колонии с неровными краями. В атмосфере СО наблюдается более обильный рост. В падающем свете колонии пневмококков имеют зеленовато-серый цвет, более светлый к периферии. Через 20-24 ч и позднее вокруг колоний пневмококка появляется зона альфа-гемолиза. Последующую идентификацию проводят по общепринятым методикам (окраска и микроскопия, учет морфологии колоний, заражение чувствительных животных, определение чувствительности к оптохину, лизис культур желчью или оксихалатами, реакция набухания капсулы, реакция агглютинации с антипневмококковыми сыворотками) .. Б зоне лизиса, вызванного сапонином, наблюдается пьщ1ный рост гемофильных палочек, сапонино-бацитроциновые диски угнетают развитие некоторых грамположительных бактерий и способствуют вьщелению гемофильных палочек, так как создаются локальные селективные условия. Мономицин угнетает развитие стафилококков, грамположительных энтеробактерий, H.influenzae и стрептококков, в то время как циркулирующие в настоящее время штаммы невмококков не чувствительны к этому антибиотику.20,4 2,8 0,038 Минимальная 23,8 3,0 0,04 Оптимальная Максимальная 27,2 3,5 0,05 Дифко Агар Хоттингера

+ в среду перед посевом добавлено 5% крови; - кровь не добавляли,

состав среды, г: мозговой экстракт 12J5,

экстракт из сердечной мышцы 5, протеозный пептон глюкоза 2, хлорид натрия 2,5. NagHPO 2,5. 9,0 3,5 + 10,0 4,0 + 1,0 4,2 ч

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬ-ТИВИРОВАНИЯ ПНЕВМОКОККОВ, содержащая питательную основу, агар-агар, хлористый натрий и дистиллированную воду, отличающаяся тем. что, с целью повышения выхода биомассы пневмококка в капсульной форме, она дополнительно содержит -цистин, экстракт кормовых дрожжей и сахарозу-, в качестве питательной основы она содержит гидролизат плаценты человека при следующем соотношении компонентов, г/л: Гидролизат плаценты человека с сухим остатком 6,3-7,4%20,4-27,2 , Агар-агар 14,0-16,0 Хлористый натрий 3,5-4,2 Е-Цистин 0,038-0,05 а 9 Экстракт кормовых (Л дрожжей2,,5 Сахароза9,0-11,0 Дистиллированная водаДо 1 л