Способ выделения липидов Советский патент 1991 года по МПК C12P7/64 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения липидов, стимулирующих биосинтез экзоферментов, из влажной биомассы микромицетов - основного отхода микробиологических произ- водтсв.

Целью изобретения является упрощение процесса и улучшение свойств получаемого продукта.

Для этого влажную биомассу (75-90%) мицелиальных грибов, например, рода Aspergillus и представителей рода Trlchoderma обрабатывают 0,3-3%-ным раствором уксусной кислоты при соотношении биомасса: раствор 1:2. Обработку проводят в течение 10-75 мин при интенсивном перемешивании и температуре 10-45°С. Далее водную фазу декантируют, а биомассу дважды промывают водой с последующей декантацией водной фазы; к влажной биомассе добавляют этанол, содержащий 0,1-5% три- натрийфосфата; соотношение влажная биомасса: экстрагент 1:3 (масса:масса), экстракцию проводят при интенсивном механическом перемешивании в течение 40-120 мин и температуре 20-45°С. Далее жидкую фазу Декантируют, а биомассу повторно экстрагируют при тех же условиях, что и для первой ступени экстракции. После декантации экстракты объединяют и концентрируют выпариванием на роторном испарителе до начала вспенивания остатка. Регенерированный этанол составляет 70% от объема экстрагента и используется при дальнейшей экстракции.

К полученной после концентрирования водно-липидной эмульсии добавляют гексан или смесь гексан:вода в соотношении 3:1 (объем:объем) при соотношении эмуль- сияхмесь 1:3. Далее смесь интенсивно перемешивают в течение 5-45мин. После окончания перемешивания происходит расслоение жидкой фазы. Верхний слой (гекса- новая фракция) отбирают и сушат над

О

ю со о ел ел

безводным сульфатом натрия в течение 15- 25 мин. После фильтрации через фильтр раствор концентрируют упариванием на роторном испарителе. Общий выход липи- дов составляет 6,4-8,0 от абсолютно сухой биомассы. Общее время, затраченное на выделение липидов, составляет 5-6 ч. Полученные липиды в концентрации 0,01-0,5% от объема питательной среды используют как добавки по двойному назначению. Во- первых, в качестве пеногасителя взамен дефицитных животных жиров (кашалотовый жир) или дорогостоящих синтетических пе- ногасителей (пропинол Б-400). Во-вторых, при добавлении липидов в питательную среду целлобиазная активность составляет 18,6-19,9 ед/мл, т.е. при значении активности 19, 8 ед/мл в 1,6 раза больше контрольных значений. Данные приведены в табл. 1. Полученные по предлагаемому способу липиды обладают следующими характеристиками.

Внешний вид: подвижное, полупрозрачное масло темно-желтого цвета. Запах: напоминает запах растительного масла. Плотность 0,98 г/см . Токсичность: не изучена. Пожаровзрывоопасность: безопасен. Количественный анализ нейтральных липидов в экстрактах, полученных по предлагаемому способу и методом Фолча, проводят методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) с последующей сканирующей денситометрией. ТСХ проводят на пластинках с силикагелем фирмы Мерк (ФРГ). Для разделения используют систему гександиэ- тиловый эфир: уксусная кислота (80:20:1). Идентификацию зон на хроматограммах проводят, используя стандарты и литературные данные. Сканирующую денситомет- рию проводят на приборе фирмы Камак (Франция). Полученные денситограммы обсчитывают, используя метод вырезания- взвешивания. Результаты количественного анализа представлены в табл. 2.

Количественный анализ жирных кислот из липидов, полученных по предлагаемому и известному способам, проводили методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Условия проведения анализа: ГЖХ проводили на хроматографе Хром-4 (ЧССР) на колонке с 5% жидкой фазой Си- лар 5 ЦП. Параметры колонки 2500x3 мм. Режим разделения - изометрический. Температуры: колонка 180°С, инжектор 210°С, детектор 250°С. Газ-носитель - азот, скорость газа 40 мл/мин. Детектирование - плаз- менно-ионизационное. Метиловые эфиры жирных кислот получают из суммарных липидов и использованием кислого метаноли- за при 80°С в течение 6 ч с последующей

экстракцией гексаном. Идентификацию пиков на хроматограммах проводили, используя стандартные образцы метиловых эфиров жирных кислот от С 16:0 до С 20:0.

Количественный анализ проводили методом триангуляции с последующей статистической обработкой при п 6.

Результаты количественного анализа жирных кислот в экстрактах, полученных по

0 известному и предлагаемому способам, представлены в табл. 3.

Пример 1. 200 г влажной биомассы микромицета Aspergillus japonlcus BKMF- 2632 обрабатывают 1,2%-ным водным рас5 твором СН3СООН при соотношении биомассы:раствора 1:2 в течение 45 мин при интенсивном перемешивании и температуре 30°С. Далее водную фазу декантируют, а к биомассе добавляют этанол, содержащий

0 2,8% тринатрийфосфата (МазРО-з). Соотношение влажная биомасса:экстрагент 1:3 (масса:масса). Экстракцию проводят в течение 80 мин при механическом перемешивании и температуре 30°С. Далее жидкую фазу

5 декантируют, а биомассу повторно экстрагируют тем же количеством экстрагента при идентичных условиях. После объединения экстрактов проводят их концентрирование выпариванием на роторном испарителе до

0 получения устойчивой водно-липидной эмульсии.

К эмульсии добавляют смесь гексан:во- да 3:1 (объемюбъем) при соотношении эмуль- сия:смесь 1:3. Далее проводят

5 перемешивание при 1000 об/мин в течение 30 мин. После окончания перемешивания и расслоения смеси верхнюю фазу отбирают. Нижнюю фазу повторно обрабатывают смесью гексан:вода при тех же условиях. Объ0 единенную верхнюю фазу сушат над безводным сульфатом натрия, затем фильтруют через вату и концентрируют выпариванием на роторном испарителе до постоянного веса твердого остатка. Полученные липиды пред5 ставляют собой темно-желтое гомогенное масло. Общий выход липидов 7,8% от веса абсолютно сухой биомассы.

Полученные липиды добавляют в питательную среду в концентрации 0,1 об.% до

0 стерилизации. В контрольном опыте продуцент целлобиазы (целлюлолитического эк- зофермента) выращивают на регламентной среде с добавлением липидов, полученных по известному способу. В другом контроль5 ном опыте в питательную среду липиды не вносят. Культивирование микромицета. А. japonicus проводят на круговой качалке при 200±20 об/мин и 28°С в колбах емкостью 0.7 л с загрузкой по 100 мл питательной среды. Стерилизацию среды проводят при 1 атм в

течение 0,5 ч при Ј0°С. Культивирование микромицета осуществляют в течение 7 сут, далее культуральную жидкость отделяют центрифугированием при 6000 об/мин и исследуют на активность целлобиазы.

При добавлении липидов, полученных предлагаемым способом, целлобиазная активность увеличивается в 1,6 раза по сравнению с контролем (внесение липидов, полученных по известному способу) и со- ставляет 19,8 ед/мл.

Пример 2. Осуществляют процесс согласно примеру 1, но влажную биомассу обрабатывают 0,5%-ным раствором уксусной кислоты при времени обработки 10 мин. Выход липидов 6,7%, активность целлобиазы 19,0 ед/мл.

Пример 3. Осуществляют процесс согласно примеру 1, но влажную биомассу обрабатывают 2,7%-ным раствором уксус- ной кислоты при времени обработки 75 мин. Выход липидов 6,6%, активность целлобиазы 18,9 ед/мл.

Пример 4. Осуществляют процесс согласно примеру 1, но влажную биомассу обрабатывают 0,3%-ным раствором уксусной кислоты при 10°С. Выход липидов 6,9%, активность целлобиазы 18,8 ед/мл.

Пример 5. Осуществляют процесс согласно примеру 1, но влажную биомассу обрабатывают 3%-ной уксусной кислотой при 45°С. Выход липидов 6.8%, активность целлобиазы 18,9ёд/мл.

Пример 6. Осуществляют процесс согласно примеру 1, но экстракцию прово- дят в течение 40 мин этанолом, содержащим 0,1% тринатрийфосфата. Выход липидов 6,7%, активность целлобиазы 19,0 ед/мл.

Пример 7. Осуществляют процесс согласно примеру 1, но экстракцию прово- дят этанолом, содержащим 5% тринатрийфосфата, в течение 120 мин. Выход липидов 6,6%, активность целлобиазы 18,6 ед/мл.

Пример 8. Осуществляют процесс согласно примеру 1, но водно-липидную эмульсию экстрагируют смесь гексан:вода в течение 45 мин. Выход липидов 6,7%, а активность целлобиазы 18,8 ед/мл.

Пример 9. Осуществляют процесс согласно поимеру 1, но экстракцию водно- липидной эмульсии гексаном проводят 5 мин. Выход липидов 6,5%, активность целлобиазы 19,2 ед/мл.

Пример 10. Осуществляют процесс согласно примеру 1, но в качестве источника получения липидов используют влажную биомассу мицелиального гриба Trlchoderma vtridae ВКПМ-13/10. Выход липидов 7,0%, целлобиазная активность 19,4 ед/мл.

Пример 11. Осуществляют процесс согласно примеру 1, используют биомассу продуцента пектиназы Aspergillus foctidus М-45. Выход липидов 7,5%, целлобиазнзя активность 19,6 ед/мл.

Пример 12. Согласно примеру 1, но обработку влажной биомассы проводят в течение 5 мин 0,2%-ной уксусной кислотой. Выход лицидов 4,2%, активность целлобиазы 13,5 ед/мл.

Пример 13. Согласно примеру 1, но обработку влажной биомассы проводят в течение 80 мин 4%-ной уксусной кислотой при 50°С. Выход липидов 2,9%, активность целлобиазы 12,8 ед/мл.

Пример 14. Согласно примеру 10, но экстракцию липидов проводят этанолом, содержащим 6,5% тринатрийфосфата, в течение 130 мин. Выход липидов 3,5%, активность целлобиазы 12, 5 ед/мл.

Пример 15. Согласно примеру 10, но экстракцию водно-липидной эмульсии проводят гексаном в течение 3 мин и полученные липиды добавляют в количестве 1%. Выход полученных липидов 4,8%, активност 14, 3 ед/мл.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет экстрагировать липиды из влажной биомассы микромицетов, являющейся отходом целевых ферментных производств. Преимущества способа состоят в том, что для экстракции используются дешевые малотоксичные и неканцерогенные растворители и реактивы, сокращается время процесса получения липидов (с 7-8 до 5-6 ч). Регенерация растворителей делает способ экологически более чистым и более экономичным. Полученные липиды отличаются по составу нейтральных липидов от продукта, полученного известным способом, а именно содержат больше триглицеридов, свободных жирных кислот, меньше стеринов и особенно их эфиров. Высокое содержание ненасыщенных триглицеридов позволяет использовать полученные липиды в качестве пеногасителей.

Основные отличия в составе жирных кислот липидов, полученных по предлагаемому и известному способам, состоят в следующем (табл. 3).

Липиды, полученные предлагаемым способом, содержат в 1,1 раза меньше ненасыщенных кислот, чем липиды, полученные по известному способу. Однако при экстракции по предлагаемому способу содержание линоленовой кислоты в липидах в 2,06 раза выше, чем в липидах, полученных по известному способу. Высокое содержание линоленовой кислоты обусловливает высокую ценность полученных липидов с

точки зрения получения из них препарата витамина (незаменимых жирных кислот).

Применение липидов, полученных по предлагаемому способу, в качестве стимуляторов биосинтеза целлобиазы при их добавлении в питательные среды позволяют производить дополнительно минимально 20-30 т продукции.

Преимущество предлагаемого способа, состоит также в том, что липиды экстрагируют из влажной, а не предварительно высушенной биомассы (промышленный способ экстракции). Такое решение приводит к существенной экономии энергии, расходуемой в процессе сушки, кроме того, позволяет избежать окисления липидов и сохранить их полезные свойства.

Фомула изобретения

1. Способ выделения липидов из биомассы микромицетов - продуцентов экзо- гидролаз, включающий экстракцию органическими растворителями, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения свойств получаемого продукта, биомассу предварительно обрабатывают 0,3-3%-ным рас-

твором уксусной кислоты при 10-45°С в течение 10-75 мин, экстракцию проводят дважды в течение 40-120 мин с использованием в качестве экстрагента этанола, содержащего 0,1-5% тринатрийфосфата, экстракты объединяют, концентрируют выпариванием, а остаток в виде водно-липид- ной эмульсии дважды экстрагируют в течение 5-45 мин гексаном или смесью гексан-вода, после расслоения смеси отбирают липидсодержащие фракции, объединяют их, сушат и концентрируют.

2.Способ по п. 1,отличающийся тем, что при экстракции водно-липидной эмульсии используют смесь гексан-вода при соотношении компонентов соответственно 3:1.

3.Способ по п. 1,отличающийся тем, что экстракцию этанолом проводят при массовом соотношении биомасса:этанол

1:3.

4.Способ по п. 1 и 2, о т л и ч а ю щ и й- с я тем, что экстракцию водно-липидной эмульсии гексаном или смесью гексан-вода осуществляют при использовании их в трехкратном объеме по отношению к объему водно-липидной эмульсии.

Таблица 1

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения липидов, стимулирующих биосинтез экзоферментов. Целью изобретения является упрощение процесса и улучшение свойств получаемого продукта. Предложен способ получения липидов из влажной биомассы микромицетов путем ее последовательной обработки 0,3- 3%-ным раствором уксусной кислоты и этанолом, содержащим 0,1-5% тринатрий фосфата. Полученную водно-липидную эмульсию экстрагируют гексаном или смесью гексан - вода. Выход липидов 6,4- 8,0% от сухой биомассы грибов. Полученные липиды используют как стимуляторы биосинтеза целлобиазы и пеногасители. 3 з.п. ф-лы, 3 табл.

30

Таблица 2

Таблица 3